1背景:现今血管再通技术的应用显著降低了心肌梗死患者的死亡率和致残率。而再灌注所造成的损伤会导致心肌细胞的凋亡和坏死,进一步扩大心肌的梗死面积。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)被认为是最有可能列入临床常规细胞治疗的细胞种类之一,它的旁分泌作用是其治疗心血管疾病的重要机制。PKCε在缺血预处理保护缺血再灌注损伤中起重要作用,且PKCε已经成为降低缺血再灌注损伤的重要靶点。2目标:在本研究中,我们试图阐明应用MSCs旁分泌因子(MSCs paracrine factors,MPF)治疗心肌缺血再灌注损伤的效果,及其的心肌保护作用机制,并且揭示PKCε在MPF保护效果中发挥作用。3方法:3.1我们用2mg/kg,5mg/kg和10mg/kgMPF与成纤维细胞分泌因子(fibroblast paracrine factors,FibroPF)10mg/kg尾静脉注射对比,并在24小时行Evans蓝/TTC染色,第二天进行TUNEL染色,第7天进行心超方法检测心功能,确定MPF在小鼠心脏缺血再灌注损伤中的保护作用,及起效剂量。用western blot方法探究再灌注15分钟后,MPF对于PKCε的磷酸化和转位效应。3.2用TUNEL和ROS检测方法,在体外验证MPF对于心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用,同时用PKCε转位抑制剂εV1-2探究PKCε在MPF保护心肌细胞中发挥的作用。通过检测线粒体ALDH2活性和4HNE的水平来证实PKCε在MPF降低心肌细胞氧化应激中的作用。3.3运用PKCε显性失活(PKCε dominant negative,PKCε-DN)的转基因小鼠,探究PKCε在MPF减小心梗面积、改善心功能、减少心肌细胞凋亡中发挥的作用。通过检测组织线粒体中4HNE水平探究MPF对于PKCε-DN小鼠的治疗效果。3.4检测MPF处理缺氧复氧心肌细胞的NO水平和NOS磷酸化和表达水平,并运用NOS抑制剂L-NAME和自由基清除剂ebselen,探究eNOS/NO通路在MPF介导的PKCε转位中的作用,探究MPF促进PKCε转位的作用机制。4结果:4.1 5mg/kg MPF尾静脉注射治疗可以有效减小缺血再灌注损伤造成的心梗面积,改善心功能,减少心肌细胞的凋亡,并且促进心肌内PKCε的磷酸化,促进PKCε从胞浆向线粒体转位。4.2 MPF可降低心肌细胞缺氧复氧损伤后的凋亡和氧化应激,提高ALDH2的活性,降低4HNE的水平。并且εV1-2可以抑制MPF对于心肌细胞产生的这些保护效果。4.3在PKCε-DN的小鼠中,MPF对于心肌缺血再灌注损伤的保护作用有所降低。心梗面积变大,心功能无明显改善,心肌细胞凋亡增加。同时,MPF治疗后,线粒体4HNE水平在PKCε-DN小鼠中比WT高。4.4 MPF可以提高心肌细胞缺氧复氧后的eNOS磷酸化水平以及NO产生,对nNOS和iNOS没有明显效果。且L-NAME和ebselen可以抑制MPF介导的PKCε转位作用。5结论:我们的研究表明,MPF可以对缺血再灌注损伤心肌产生保护作用,并且PKCε转位机制在MPF的保护效果中发挥重要作用。我们的结果也提示eNOS/NO通路可能是MPF介导PKCε转位的重要机制。