研究目的肺癌一种常见的呼吸道肿瘤,其高发生率和高死亡率使其成为全世界肿瘤致死率较高的肿瘤类型之一,虽然目前较多的治疗方案被提出,但是仍不能十分有效的缓解其癌症致死率。肺癌根据病理分型可分为非小细胞癌和小细胞癌,而将近80-90%的肺癌为非小细胞肺癌,由于非小细胞肺癌在肺癌类型中占据如此大的比例,因此有效的治疗策略及新型药物的开发对于减少肺癌患者的死亡率或改善非小细胞肺癌患者的术后生存对于肺癌的治疗显得尤为重要。虽然目前关于非小细胞肺癌的治疗已有很大的进步,如之前的EGFR等致癌因子的单抗药物的开发,发展到最近的靶向PD-1及PD-L1的单抗治疗,以及目前十分热门的免疫治疗。但是由于非小细胞肺癌患者的个体差异性,及EGFR突变,以及对化疗药物的耐药性,使得肺癌的诊断和治疗仍然需要不断的改善与探索。凋亡诱导因子AIF(Apoptosis Induce Factor)是细胞线粒体中的黄素类蛋白分子,最初被命名为凋亡诱导因子是因为其在多种刺激或培养条件下可转运进细胞核,定位于核的AIF会引起染色质聚集或DNA片段化等从而拥有诱导凋亡的能力。近年来研究发现,AIF除了诱导凋亡之外还可调控细胞线粒体呼吸链完整性及细胞氧还状态平衡,以及调控线粒体嵴的结构。而目前关于线粒体与肿瘤的相关性研究日趋深入,基于AIF在调控线粒体稳态方面的关键作用,且AIF与肿瘤发生发展过程的相关性研究较少,本研究将着重探讨凋亡诱导因子AIF在调控非小细胞肺癌细胞生长方面潜在的作用机制,期望为非小细胞肺癌的早期诊断和治疗寻找新的检测标志物和治疗靶点。研究方法1:应用western blot蛋白质免疫印迹技术,实时荧光定量PCR技术及免疫组化技术分析蛋白质分子的表达水平及相关分子的m RNA转录水平;2:应用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测AIF敲低后细胞的生长能力,通过裸鼠荷瘤实验研究AIF敲低后非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞在裸鼠体内的生长情况;3:通过seahorse生物能量分析仪检测非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞在不同处理后的氧耗率和糖酵解速率;4:应用流式细胞术检测细胞的ROS水平;5:应用葡萄糖检测试剂盒检测细胞在不同处理后的葡萄糖摄入水平,通过乳酸检测试剂盒分析不同条件下A549和H1299细胞系的胞外乳酸含量;6:采用Kaplan-Meier生存分析法对非小细胞肺癌患者的术后生存情况进行统计分析,同时通过卡方检验研究AIF及HIF1-α的表达水平与非小细胞肺癌患者的临床病理参数之间的相关性。研究结果1:AIF在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中显著高表达,包括蛋白质水平和m RNA水平;2:AIF敲低后会显著抑制非小细胞肺癌细胞系A549及H1299的细胞增殖,并抑制A549细胞系在裸鼠体内的成瘤能力;3:AIF敲低后显著降低线粒体呼吸链相关复合体亚基的蛋白质水平,但并不改变线粒体DNA拷贝数及线粒体DNA编码的13个复合体亚基的m RNA转录;4:敲低AIF后显著抑制线粒体氧化磷酸化水平,但对有氧糖酵解过程并无显著影响;5:AIF下调后可降低HIF1-α在低氧条件下的稳定性及其下游分子的基因转录,同时降低细胞在低氧培养下的葡萄糖摄入和乳酸的生成;6:AIF敲低后会抑制细胞在低氧条件下细胞的代谢重编程;7:AIF通过影响ROS的产生调控HIF1-α在低氧条件下的稳定性及细胞代谢;8:Kaplan-Meier生存分析结果表明AIF与HIF1-α的表达水平与非小细胞肺癌患者的预后呈负相关,卡方检验的结果显示AIF与HIF1-α的表达与非小细胞肺癌患者的临床分期和淋巴结转移之间具有显著的相关性。结论本课题通过实验研究表明,AIF在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中显著高表达,并且敲低AIF后可显著抑制肿瘤细胞在体内体外的生长能力。细胞实验的结果表明AIF可影响细胞线粒体呼吸链的稳态,调节细胞氧还状态平衡,最终通过影响ROS调控HIF1-α在低氧条件下的稳定性,并调节细胞在低氧条件下的代谢重编程,从而调控非小细胞肺癌细胞的生长。此外,通过对临床数据进程免疫组化分析,结合相关统计学方法,发现AIF和HIF1-α高表达的非小细胞肺癌患者具有较差的预后。同时,AIF表达与患者的临床分期和淋巴结转移之间具有显著的相关性,HIF1-α表达则与临床分期,淋巴结转移和肿瘤大小之间均具有显著相关性。通过本课题的研究,提出AIF除了作为凋亡诱导因子发挥功能之外,还可通过影响ROS调控HIF1-α的稳定性并最终调节细胞生物能量代谢参与非小细胞肺癌细胞生长的控制,这一机制的阐明或许能够为非小细胞肺癌的早期诊断和治疗提供一个新的理论依据。