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第一部分酒精下调NAD+-SIRT1致大鼠肝脏胰岛素抵抗及白藜芦醇干预机制研究目的:探讨长期酒精摄入诱导大鼠肝组织胰岛素抵抗及白藜芦醇干预作用的潜在分子机制。方法:动物实验:雄性成年72只SD大鼠(180-220 g)随机分为6组,每组12只:正常对照组(Con)、低剂量酒精组(Leth,0.8 g/kg.bw/d)、中剂量酒精组(Meth,1.6 g/kg.bw/d)、高剂量酒精组(Heth,2.4 g/kg.bw/d)、白藜芦醇对照组(Res,100 mg/kg.bw/d)和白藜芦醇干预组(Heth+Res,Heth:2.4 g/kg.bw/d,Res:100 g/kg.bw/d)。实验第12周和21周进行OGTT和ITT实验,实验22周结束后,每组随机选取5只大鼠进行急性胰岛素刺激实验(0.8 U/kg.bw),留取血清及肝脏样本用于检测胰岛素敏感性相关指标、肝脏中胰岛素信号通路中关键蛋白磷酸化IRS2、p-PI3K/PI3K、Akt2和SIRT1蛋白表达情况及NAD+/NADH 比值,以及肝脏中酒精代谢酶的表达及活力。原代大鼠肝细胞实验:不同浓度酒精暴露24 h后CCK-8实验检测肝细胞活性,Western blot检测酒精和白藜芦醇单独或联合作用24 h后SIRT1、p-Akt/Akt及酒精代谢酶关键蛋白表达的变化情况。此外,酒精、白藜芦醇、SIRT1激活剂与抑制剂、NAD+的补充剂与抑制剂单独或联合干预24 h,探讨白藜芦醇改善酒精诱导胰岛素抵抗相关分子机制。结果:动物实验第12周时,OGTT及ITT实验结果显示仅高剂量酒精组大鼠出现较为明显的胰岛素抵抗。动物实验结束时,中、高剂量组大鼠空腹血糖(P<0.05,P<0.01)、HOMA-IR 值(P<0.05)和 OGTT(P<0.05,P<0.001)与 ITT(P<0.05,P<0.01)曲线下面积明显增加,而HOMA-β值(P<0.01,P<0.001)及肝糖原含量显著下降(P<0.01)。与对照组大鼠相比,高剂量酒精摄入显著下调肝组织胰岛素信号通路关键蛋白IRS-2、p-PI3K/PI3K及Akt2的水平(P<0.01),同时降低肝组织 NAD+/NADH 比值(72%,P<0.01)和 SIRT1 蛋白水平(58%,P<0.01)。大鼠原代肝细胞实验结果显示酒精暴露可显著降低肝细胞内SIRT1蛋白水平(32%,P<0.05)、NAD+/NADH 比值(33%,P<0.01)及胰岛素敏感性指标p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt水平,SIRT1激活剂SRT1720干预可显著上调酒精暴露所抑制的p-PI3K/PI3K(41%,P<0.01)和 p-Akt/Akt(105%,P<0.001)水平,NAD+补充剂NMN干预则明显提高酒精暴露所抑制的SIRT1蛋白水平(53%,P<0.05),以上结果提示酒精诱导肝脏胰岛素抵抗与其降低NAD+/NADH 比值和SIRT1蛋白表达的作用密切相关。此外,动物实验与细胞实验均显示白藜芦醇可通过提高酒精干预所抑制的NAD+/NADH 比值、SIRT1蛋白及胰岛素信号通路关键分子蛋白表达,改善酒精诱导的胰岛素抵抗作用。结论:长期酒精摄入可通过降低大鼠肝组织NAD+/NADH 比值而抑制SIRT1蛋白表达,扰乱胰岛素信号通路并诱发胰岛素抵抗,白藜芦醇则通过调节酒精代谢过程而提高NAD+/NADH 比值,上调SIRT1蛋白并恢复胰岛素信号通路,发挥对酒精诱导大鼠胰岛素抵抗的保护作用。第二部分:酒精下调NAD+-SIRT1致大鼠胰岛β细胞衰老及白藜芦醇干预机制研究目的:探讨酒精诱导胰岛β细胞衰老及白藜芦醇干预作用的潜在分子机制。方法:动物实验:分组及大鼠饲养同第一部分,实验结束后留取胰腺组织,利用HE染色、SA-β-gal染色、免疫荧光及免疫组化法进行胰岛病理学分析。大鼠源性胰岛β瘤细胞系INS-1细胞实验:不同浓度的酒精、白藜芦醇、SIRT1的激活剂与抑制剂、p38MAPK的抑制剂、NAD+的激活剂与抑制剂暴露24 h后CCK-8实验检测INS-1细胞活力。此外,以上干预物单独或联合干预24 h后,SA-β-gal 染色检测 INS-1 细胞衰老状态,Western blot 检测 SIRT1 及 p38MAPK/p16衰老通路关键蛋白表达量,同时利用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)评价INS-1细胞的胰岛素分泌能力。结果:与对照组相比,胰腺SA-β-gal染色结果显示高剂量酒精组大鼠胰岛β细胞衰老阳性细胞染色面积明显增加(156%,P<0.001),胰腺免疫荧光及免疫组化染色结果显示高剂量酒精组大鼠胰岛β细胞的SIRT1(P<0.05)、Bmi1(P<0.01)、cyclin D2(P<0.001)和 Ki67(P<0.001)蛋白表达明显下降,p-p38MAPK(P<0.001)和p16(P<0.001)明显增多。在体外实验中,酒精暴露明显增加SA-β-gal染色阳性INS-1细胞数(P<0.001),显著降低INS-1细胞中的NAD+/NADH比值(58%,P<0.001)、SIRT1的蛋白水平(36%,P<0.05),上调p38MAPK磷酸化(52%,P<0.01)及 p16 蛋白(82%,P<0.001)水平。p38MAPK 抑制剂 SB203580干预明显抑制酒精诱导增加的p16蛋白表达,SIRT1激活剂SRT1720干预后由酒精诱导升高p38MAPK的磷酸化水平(36%,P<0.01)及p16(2%,P<0.05)蛋白水平明显减少,NAD+补充剂NMN(烟酰胺单核苷酸)干预增加酒精干预所抑制的SIRT1蛋白表达(42%,P<0.05),同时改善酒精诱导的相关衰老指标,以上结果提示酒精暴露通过下调NAD+/NADH 比值而降低SIRT1表达,继而激活p38MAPK-p16衰老通路诱发β细胞衰老。与此同时,酒精暴露可诱导UCP2蛋白表达升高,GSIS实验显示酒精暴露使INS-1细胞的胰岛素分泌功能显著减弱,而SRT1720及NMN干预均可抑制UCP2表达并恢复INS-1细胞胰岛素分泌功能。此外,动物实验与细胞实验均显示白藜芦醇可通过提高酒精诱导抑制的NAD+/NADH比值、SIRT1蛋白并抑制p38MAPK/p16衰老通路及UCP2蛋白表达,改善酒精诱导的β细胞衰老及分泌功能障碍。结论:长期酒精摄入可通过下调NAD+-SIRT1通路,激活p38MAPK-p16衰老信号通路,诱导胰岛β细胞衰老发生,引发β细胞总量减少,同时通过上调UCP2蛋白,抑制β细胞胰岛素分泌功能,并由此导致胰岛功能障碍而加速糖尿病进展。白藜芦醇干预则可通过上调NAD+/NAHD 比值及SIRT1蛋白表达而抑制p38MAPK-p16衰老信号通路,改善β细胞衰老及其胰岛素分泌功能,延缓糖尿病的发生。综上所述,实验结果显示酒精通过降低机体NAD+/NAHD 比值并进一步抑制SIRT1蛋白表达,一方面阻滞胰岛素信号转导而诱发大鼠肝组织胰岛素抵抗,另一方面激活胰岛β细胞衰老相关通路,诱导β细胞衰老而导致胰岛功能障碍,两方面的损伤效应共同加速糖尿病进展。因此,本研究结果提示NAD+/NAHD 比值的下降及由此降低的SIRT1蛋白表达可能是酒精性糖尿病发生的核心机制。此外,白藜芦醇可通过调控NAD+-SIRT1途径,发挥对酒精诱导的胰岛素抵抗及β细胞衰老的双重保护作用,延缓糖尿病进程。