目的膀胱癌是一种常见的泌尿生殖系恶性肿瘤,其侵入尿路上皮下肌肉和血管系统是导致恶性转移、进展的决定性因素。然而,目前我们对其中的机制知之甚少,主要原因是缺乏可靠的实验模型,模拟体内侵袭和转移的生物学过程。因此,我们希望能够构建出尿路上皮细胞体外分化模型,借助这一工具对膀胱正常细胞向肿瘤细胞突变的过程进行研究。首先,探索利用成份明确的培养体系将人多能干细胞(hPSC)分化成具体的膀胱尿路上皮细胞(BUC)的方法。借助此分化方案研究膀胱组织再生与体外膀胱癌的发病机理。其次,鉴于目前对于肿瘤上皮-间充质转化(EMT)的调控基因及相应机制尚不够清晰,靶向干预肿瘤EMT的药物和疗法寥寥无几的事实,我们拟通过单细胞测序技术确定膀胱癌细胞中与EMT相关的特征性基因和生物学过程。同时,阐明相应基因在细胞亚群水平上促进膀胱癌进展和转移的分子机制。方法将人胚胎干细胞(hESC)分化为确定内胚层细胞(DE),再通过维甲酸处理后的角质形成细胞特异性无血清培养基(KSFM)进一步分化为BUC。为了优化DE(Definitive Endoderm,定形内胚层)分化阶段,B27和ITS两种细胞培养补充剂被分别加入无血清培养基中检测分化效果。为了证明DE细胞可以通过成份明确的培养体系成功分化为BUC,我们采用了 DMEM/F12混合培养基和KSFM两种培养基进行对比。通过实时RT-PCR测定特定生物标记物的RNA的含量。借助免疫细荧光技术确定最终分化的BUC中特定基因的表达。在分离了 4例浸润型膀胱癌病人的肿瘤组织和对侧形态正常膀胱黏膜消化后,进行单细胞测序。比较高EMT组与低EMT组的病人,得到相应的差异表达基因。通过韦恩图,确定同时出现在多组差异表达中的基因。再通过TCGA数据库中的预后分析、筛选,结合Oncomine数据库,从基因差异表达、生存分析和肿瘤分期等角度综合判断,选取了中性α-葡糖苷酶(GANAB)基因。最后,通过膀胱癌细胞的石蜡组织切片,检测该基因的表达。通过划痕愈合实验、基质胶小室侵袭实验以及肿瘤细胞悬浮成球实验验证GANAB对膀胱癌细胞EMT的影响。结果我们成功将hESC在维甲酸处理后的无血清纯化学培养基中依次分化为DE和BUC。实验结果表明在分化DE阶段使用B27时,虽然细胞的死亡率略高,但是CXCR4和SOX17两个指标都高于使用ITS的结果。并且我们发现KSFM实验组的尿路上皮特异性基因的表达,如CK20、UPⅡ、UPIb都有显著提高。免疫组化结果显示,分化后的BUC显著表达UPⅢA和CK8/18/20。此外,通过对4例高级别浸润型膀胱癌进行单细胞测序,结合数据分析和挖掘,鉴定出了其基本特征,并确定了 GANAB是一个与EMT高度相关的调控基因,显著促进膀胱癌的迁移、侵袭和肿瘤干细胞特性。此外,我们将通过揭示其上游相关通路和下游作用靶点及作用机制,补充肿瘤EMT的生物学机制,这些会为膀胱癌的临床防控提供理论依据。结论初步将hESC在维甲酸处理后的无血清纯化学培养基中依次分化为DE和BUC。确定了 GANAB是一个与EMT过程高度相关的调控基因,可显著促进膀胱癌的迁移、侵袭和肿瘤干细胞特性。图9表1参66