背景近年来慢性失眠的发病率呈上升趋势,已成为全球性的公共卫生问题。长期的慢性失眠会导致糖尿病、高血压及心脑血管疾病。慢性失眠的发病机制尚不明确,表观遗传可能通过环境对基因的影响发挥作用。DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰之一,对基因的表达与沉默起重要的调节作用。目前研究已发现部分与失眠相关的基因,然而其在慢性失眠中的作用有待探讨。本研究拟通过全血样本在全基因组水平分析慢性失眠患者的DNA甲基化特征,并采用目的区域甲基化水平测序技术对失眠相关基因进行研究,以期从表观遗传学角度为慢性失眠的发病机制提供新的见解。目的1.通过Methylation EPIC Bead Chip（850K芯片）分析慢性失眠患者与健康对照全基因组DNA甲基化水平差异,筛选出慢性失眠患者DNA甲基化水平显著变化的基因,并进行功能富集分析,进而阐明慢性失眠患者的DNA甲基化模式。2.采用目的区域甲基化水平测序（Methyl Target）分析失眠相关基因BDNF、PAX8以及850K芯片筛选出的基因在慢性失眠患者与健康对照中的DNA甲基化水平差异,探讨慢性失眠患者与健康人群相关基因的甲基化变化,从而寻找与慢性失眠相关的DNA甲基化分子标志物。方法1.根据严格纳入和排除标准,招募在新乡医学院第二附属医院住院的慢性失眠患者及同期的健康志愿者。对慢性失眠患者采用多导睡眠监测（Polysomnography,PSG）分析失眠患者客观睡眠情况,监测指标包括:睡眠总时间、睡眠潜伏期、快速动眼（REM）期睡眠时间及睡眠效率。收集所有样本的一般相关信息,并以匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh sleep quality index,PSQI）量表评估睡眠质量,失眠严重程度指数（Insomnia Severity Index,ISI）量表评估失眠严重程度,汉密顿焦虑量表（Hamilton Anxiety Scale,HAMA）、汉密顿抑郁量表（Hamilton Rating scale for Depression,HAMD）评估焦虑及抑郁症状。其中850K芯片组包括:8例慢性失眠患者和8例健康对照。Methyl Target组包括:30例慢性失眠患者和30例健康对照。2.收集8例慢性失眠患者和8例健康对照全血样本,分别提取DNA并进行亚硫酸盐转化,通过850K芯片分析进行杂交,对850000多个甲基化位点进行检测,并进行数据处理,获得差异基因。对差异基因进行GO功能分析（Gene Ontology Analysis,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）功能分析,并采用Bumphunter算法获得差异甲基化区域及相关基因。3.对30例慢性失眠患者和30例健康对照进行Methyl Target,分析失眠相关基因BDNF、PAX8以及850K芯片筛选出的基因启动子区域甲基化水平在慢性失眠患者与健康对照中的差异。4.使用统计学软件SPSS 22.0进行统计分析,P＜0.05认为差异具有统计学意义。结果1.一般资料分析,850K芯片组:慢性失眠组和健康对照组的性别、年龄、教育年限、HAMA和HAMD差异均无统计学意义（P＞0.05）,PSQI和ISI差异具有统计学意义,PSQI（t=10.16,P＜0.05）,ISI（t=22.10,P＜0.05）。Methyl Target组:慢性失眠组和健康对照组的性别、年龄、教育年限差异均无统计学意义（P＞0.05）,PSQI、ISI以及HAMA和HAMD差异具有统计学意义,PSQI（t=15.78,P＜0.05）,ISI（t=37.28,P＜0.05）,HAMA（t=3.22,P＜0.05）,HAMD（t=2.22,P＜0.05）。2.通过慢性失眠组与健康对照组全基因组DNA甲基化水平比较,共筛选出369个甲基化位点存在甲基化水平差异（P＜0.05且delta Beta绝对值＞0.1即为差异甲基化位点）,其中慢性失眠组相对于健康对照组发生甲基化水平上调位点153个,甲基化水平下调位点216个,所有差异甲基化位点共覆盖175个基因。GO分析和KEGG通路分析发现,差异基因的生物功能主要集中在神经系统发育、血管平滑肌收缩、细胞粘附和钙离子通道。差异甲基化区域分析发现23个差异甲基化区域,覆盖29个相关基因,其中LHX6基因与失眠相关且差异最具有统计学意义（P＜0.001）。3.采用Methyl Target分析BDNF、PAX8、LHX6基因启动子区域甲基化水平,三者在慢性失眠组和健康对照组的甲基化水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论1.慢性失眠患者全基因组甲基化水平较健康对照发生显著变化,这可能是导致慢性失眠发生的重要表观遗传学机制之一。2.慢性失眠患者中BDNF、PAX8、LHX6基因启动子区域甲基化水平未发生显著变化。