IL-17在EAM继发的心肌纤维化中的作用研究

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目的:   心肌炎是一种常见的心血管疾病,其中部分患者可能会发展为扩张型心肌病,甚至心衰。病毒感染是心肌炎致病最常见的原因,但是其他病原体感染以及自身免疫性疾病也有诱发心肌炎的可能。Th17细胞是最经典的产生IL-17的辅助性T细胞,在自身免疫性疾病中起着重要的作用,其在自身免疫性心肌炎形成过程中扮演怎样的角色,正在引起人们的关注。有文献报道,IL-17是心肌炎继发心肌重塑及扩张性心肌病的重要因素。然而,IL-17及产生IL-17的细胞促进心肌纤维化的机制尚不十分清楚。   本课题通过体内外两方面研究阐明IL-17在EAM继发的心肌纤维化中的作用及其所依赖的分子机制。   方法:   (1)实验性自身免疫性心肌炎模型的诱导   根据文献,用鼠心肌肌球蛋白特定序列氨基酸MyHC614-629混合弗氏完全佐剂于第0天和第7天皮下免疫BALB/c小鼠,建立小鼠EAM模型,无MyHC614-629的弗氏完全佐剂作为对照组。通过心肌病理切片HE染色及天狼星红胶原染色判断模型是否成功,评判炎症及纤维化程度。收集不同时期小鼠血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-17水平。   (2)小鼠成纤维细胞的分离与处理   体外分离和培养小鼠心肌成纤维细胞,PCR检测IL-17受体IL-17RA及RC的表达。用100ng/mlIL-17刺激心肌成纤维细胞24h,48h,72h,免疫荧光染色及western blot检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达情况。   (3)IL-17诱导心肌纤维化的分子机制   以100ng/ml IL-17刺激心肌成纤维细胞0min,5min,15min,30min,45min,60min,western blot检测PKCβ,Erk1/2,p65磷酸化的水平。用10nM PKCβ抑制剂提前2h阻断该信号分子后,100ng/mlIL-17刺激心肌成纤维细胞24h,免疫荧光染色及western blot检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达情况。   (4)疾病的干预治疗   按(1)中的方法诱导EAM模型,从第14天开始隔天尾静脉注射10ug PKCβ抑制剂,第35天处死;对照组注射相同剂量DMSO。HE染色及天狼星红胶原染色检测胶原表达。   结果:   (1)成功建立了小鼠自身免疫性心肌炎模型。EAM模型小鼠心肌内可见淋巴细胞浸润,炎症后期成纤维细胞增生,胶原沉积,心肌细胞受损,排列紊乱。胶原染色显示随病程进展心肌纤维化程度逐渐加剧。ELISA检测结果显示,炎症高峰期(21天)小鼠血清中IL-17含量(n=6,623.37±53.08 pg/ml)明显增高,与PBS对照组(n=6,97.34±19.37 pg/ml)相比有明显差异(P<0.05)。   (2)成功分离小鼠心肌成纤维细胞,其表面表达IL-17RA及RC。100ng/ml刺激心肌成纤维细胞24h后,免疫荧光染色及western blot显示Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达明显增高,与PBS对照组相比有统计学差异(P<0.05)。刺激72h后Ⅰ型及Ⅲ型胶原细胞内表达量下降,与PBS对照组相比无差异(P>0.05)。   (3)IL-17刺激心肌成纤维细胞后Western blot结果显示PKCβ、Erk1/2、p65分别于15min、30min、45min磷酸化水平达到最高。PKCβ抑制剂阻断后,Ⅰ型与Ⅲ型胶原的表达量明显减低(P<0.05)。   (4)心肌病理切片HE染色及天狼星红胶原染色显示与对照组相比,PKCβ抑制剂治疗组小鼠心肌成纤维细胞增生程度明显减低,胶原沉积明显减轻。   结论:   (1)本研究证实IL-17参与EAM后期心肌纤维化的过程。   (2)IL-17介导的心肌纤维化是通过PKCβ-ERK1/2-NF-κB信号通路。
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