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目的:探讨由实验室合成的鬼臼毒素衍生物Z-26-2诱导人源多药耐药肿瘤细胞K562/A02凋亡在体外的作用效果及机制,为抗肿瘤药物研制提供理论基础。
方法:
1 MTT法和SRB法检测Z-26-2对各种肿瘤细胞增殖/抑制作用。
用96孔培养板接种对数生长期肿瘤细胞,培养24h后,加入不同浓度Z-26-2(100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L),48h后以MTT法和SRB法测定Z-26-2在体外对多种肿瘤细胞的IC50或G150值。用SRB法检测鬼臼毒素新衍生物对K562/A02细胞生长曲线的影响。
2光学显微镜、荧光显微镜观察Z-26-2作用后K562/A02细胞形态结构改变。
在对数生长期的K562/A02细胞中加入不同浓度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L),作用于K562/A02细胞24h,Giemsa染色后光学显微镜观察照相并保留结果。同法进行Hoechst33342荧光染色,以紫外光(340nm)激发Hoechst,荧光显微镜观察照相并保留结果。
3琼脂糖凝胶电泳分析Z-26-2对K562/A02细胞染色体DNA断裂的影响。
在对数生长期KBV200细胞,加入不同浓度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用24h后抽提样本DNA,于1.5％琼脂糖胶电泳,电泳完成后用凝胶成像系统照相。VP-16(10μmol/L)为阳性对照。
4流式细胞术分析Z-26-2对K562/A02细胞凋亡率及细胞周期的影响。
对数生长期K562/A02细胞,加入不同浓度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)药物,分别作用12 h、24 h后用流式细胞仪检测凋亡率以其及对细胞生长周期的影响。
5 RT-PCR法检测不同浓度Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)对K562/A02细胞mdr-1、p53、p21、caspase-3 mRNA表达的影响。
结果:
1 Z-26-2的体外抗肿瘤作用。
本课题通过MTT和SRB法实验发现Z-26-2对多种肿瘤细胞均有较强的抑制作用。IC50范围在0.68μmol/L～15μmol/L之间,对skov3的作用最明显,IC50值达到0.68μmol/L。
从SRB结果可看出:Z-26-2对人红白血病细胞(K562)及阿霉素诱导的多药耐药株(K562/A02)均有抑制作用,其GI50分别为1.4μmol/L、1.6μmol/L,对多药耐药细胞及其母本细胞均有较强的抑制作用。
通过绘制药物作用K562/A02细胞6天的生长曲线,发现不同浓度的Z-26-2对K562/A02细胞的生长抑制作用显著,且呈现较好的量效关系。
2鬼臼毒素衍生物Z-26-2不同浓度组对K562/A02细胞周期的影响
本文采用流式细胞仪分别检测不同浓度组的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用12h和24h后对K562/A02细胞周期的影响。结果显示与空白对照组相比较,不同浓度的Z-26-2在12h、24h时间点都可将细胞周期阻断在S期。这说明Z-26-2作用12h、24h后,药物进入细胞核内,并将细胞阻滞于DNA合成期。
3检测鬼臼毒素衍生物Z-26-2诱导K562/A02细胞的凋亡的效果
把不同浓度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用于K562/A02细胞24h后,分别用Giemsa染液和荧光染料Hoechst33342/PI对细胞进行染色,前者将细胞核染成粉红色,胞浆染成蓝紫色。未加药组的细胞核染色均一、结构完整、核浆比值大；给药组细胞可见细胞核形态呈现细胞凋亡的典型特征:核膜皱缩,核固缩,核碎裂。用荧光染料Hoechst33342对细胞进行染色,在紫外光激发下发蓝色荧光,荧光显微镜下观察可发现K562/A02细胞凋亡的形态学变化。细胞核染色质发生聚集、碎裂,细胞膜不断出芽、脱落,细胞变成数个大小不等的凋亡小体,伴随着Z-26-2浓度的加大,镜下具有这种细胞形态变化的细胞数量愈加明显,凋亡细胞的比例逐渐增加。并且鬼臼毒素新衍生物浓度的越高,细胞凋亡形态的变化愈显著,凋亡细胞的比例愈多,显示出明显的剂量依赖性。在经典的DNA降解断裂检测实验中,用不同浓度的Z-26-2分别作用于KBv200细胞24h,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可呈现典型的“DNA梯子样”图谱。应用流式细胞仪进行肿瘤细胞凋亡率测定,可见经不同浓度的Z-26-2(μmol/L、2μmol/L)作用于K562/A02细胞24h后,于正常G0/G1细胞群前出现DNA低染细胞群,称为“A0细胞群”或“亚G1细胞群,Sub-G1”即凋亡细胞群,该现象被认为是细胞发生凋亡的标志之一,且凋亡细胞的比例随着鬼臼毒素新衍生物浓度的升高而增大,呈一定的剂量依赖性。综上结果可以认为鬼臼毒素新衍生物高浓度作用于K562/A02细胞时能够诱导细胞的凋亡。
4 Z-26-2对K562/A02细胞多药耐药性基因mdr-1、凋亡相关基因p53、p21、caspase-3表达
本实验观察了Z-26-2对mdr-1基因及凋亡相关基因p53、p21和caspase-3的mRNA表达的影响。经不同浓度的Z-26-2(1μmol/L、2μmol/L)作用于K562/A02细胞24小时,RT-PCR结果显示Z-26-2可增加p53、p21、caspase3的mRNA表达,同时降低了mdr-1mRNA的表达,结果同对照组相比均有显著性差异(P<0.05),且呈一定的剂量依赖性。提示Z-26-2诱导细胞凋亡的作用极可能依靠上调了p53、p21、caspase-3表达,同时下调多药耐药性基因mdr-1 mRNA的表达,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。
结论:鬼臼毒素衍生物Z-26-2的结构是实验室首次合成,并通过实验室体外实验,证明了其具有显著的体外抑制多种人源性肿瘤细胞生长的特性,对多药耐药肿瘤细胞抑制作用也同样显著,根据实验结果推断,其主要是将肿瘤细胞生长周期阻断在S期,能够同时上调p53、p21,、caspase-3基因mRNA水平的表达量,下调mdr-1基因mRNA水平的表达量而达到影响肿瘤细胞的增殖与诱导凋亡的作用。