背景心力衰竭是由于持续性异常神经激素及机械应力变化引起的,目前仍是全球主要的死亡原因之一。病理性应激反应如高血压常引起心肌肥大、心肌细胞凋亡和纤维化从而改变微血管结构和心室扩张进而导致心肌功能异常及心力衰竭。然而具体的机制还不明确。最近,有人提出氧化应激可能是心血管疾病发生的原因,然而应用非选择性抗氧化应激的方法来治疗心血管疾病常常是无效甚至还是有害的。因此,更有靶向性的针对氧化应激的来源或内源性抗氧化应激防御系统或许能成为一种更有效的治疗手段。本研究中,我们揭示了Nrf2作为一种可以控制基础状态下及诱导性抗氧化基因和其它细胞保护性Ⅱ相解毒酶的表达从而起到在多种病理情况下对病理性心肌重塑和功能失调起到负性调节的作用。有报道指出Nrf2在硫化氢介导的心肌保护中具有关键作用。我们认为Nrf2或许可以作为治疗心肌细胞损伤和心功能异常的药物靶向。尽管研究证实Nrf2对心肌具有明确的保护作用,但在动物体内还未证实心肌细胞特异型表达Nrf2和心肌保护之间的直接关系如何。近来越来越多的研究表明由于还原性谷胱甘肽的增加引起还原性应激可引起蛋白质聚集导致的心肌病的发生。在蛋白聚集性心肌病中,存在另外一种可能性：Nrf2慢性激活导致氧化应激可能是还原性应激介导的心力衰竭的主要原因。尽管还不清楚Nrf2是否存在这种“负面”影响,然而Nrf2能够参与自噬过程对蛋白聚集体进行调节。自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程。自噬和泛素蛋白酶体系统(UPS)细胞内异常蛋白质降解和清除的主要途径。UPS通常泛素化目的蛋白从而降解可溶性错误折叠或损伤的蛋白质,而自噬可以清除不可溶的泛素化蛋白聚集体。一旦UPS功能受损,泛素化可溶性异常蛋白聚集成不可溶性有毒的蛋白聚集体从而自噬被激活成为体内重要的清除异常蛋白质的主要途径。此外在很多心肌病和心力衰竭过程中心肌蛋白酶体往往受损会产生大量的心肌蛋白聚集体,此时心肌细胞内自噬的激活可能对心脏起到保护性或者损伤性作用。以上表明,在心肌重塑和心力衰竭过程中Nrf2可能通过调节自噬来调节蛋白质变化。因此,本研究试图揭示心肌特异性Nrf2激活对心肌重塑和心功能损伤的影响,明确Nrf2通过调节自噬清除蛋白聚集体从而保护心肌的可能性。本研究结果表明在心脏中Nrf2持续性激活有利于通过自噬清除蛋白聚集体从而抵御心功能不全的发生。此外,Nrf2不能抑制毒性泛素化蛋白质引起的心肌细胞凋亡但能够通过促进自噬清除毒性蛋白聚集体明显抑制坏死的发生。目的1.明确心肌特异性Nrf2激活对心肌重塑和心功能损伤的影响；2.揭示Nrf2是否通过自噬清除蛋白聚集体从而起到保护心肌的作用方法1.制备心肌细胞特异性Nrf2过表达的转基因小鼠我们用含鼠5.5kbα肌球蛋白重链(a-MHC)基因启动子(Jeffery Robbions博士惠赠)的转基因盒制备了FVB遗传背景的Nrf2ctg小鼠。2.主动脉缩窄术(TAC)8周龄雄性C57B16/J小鼠(体重30±2g),腹腔注射氯胺酮(80mg/kg)和甲苄噻嗪(5mg/kg)麻醉。胸骨上切迹处水平切口,切开后不需要进入胸膜腔就可直接看到横主动脉弓,从而避免了使用机械通气。分离右无名动脉和左颈总动脉之间的主动脉弓,垫扎27-gauge针头(0.41mm),7-0丝线结扎,然后抽出垫扎针,缝合切口。假手术(sham)组不进行主动脉弓结扎,余过程同手术组。3.成年小鼠心肌细胞培养肝素抗凝,小鼠麻醉后,开胸快速取出心脏,快速将主动脉固定在胶原酶溶液灌注系统上,消化细胞外基质。主动脉下方剪下心脏,轻轻将其撕碎,含血清的灌注液终止消化。然后心肌细胞复钙,得到钙耐受心肌细胞。心肌细胞孵育在Ca2+浓度逐步升高的溶液中,直至达到1.2mM Ca2+。将细胞培养于包被层粘连蛋白的培养皿中使其贴壁。贴壁后去除悬浮细胞得到心肌细胞。4.细胞死亡检测我们应用LDH细胞毒性检测试剂盒(630117,Clontech)来检测细胞死亡。细胞活性用以下公式计算得出：细胞活性=(实验组细胞裂解液中LDH)/(对照组细胞裂解液中LDH)×100%.相反,细胞死亡率=(实验组上清中LDH释放量)／(实验组上清LDH释放量+细胞裂解液中LDH量).5.数据分析结果1.成功制备心肌细胞特异性Nrf2过表达的转基因小鼠2.心肌细胞特异性Nrf2表达可以有效抑制慢性压力负荷引起的心肌重塑和心功能损伤。3.Nrf2促进自噬小体的形成,增强自噬流。4.Nrf2虽然不能抑制细胞凋亡但可以通过清除心肌细胞中泛素化蛋白聚集体从而抑制坏死的发生。结论1.在小鼠体内,心肌细胞特异性Nrf2激活能够抑制TAC术后持续性后负荷增加导致的心肌氧化应激的发生如心肌凋亡、纤维化、心肌肥大和心功能异常。2.持续性Nrf2激活能够使自噬小体增加从而利于心肌细胞中泛素化蛋白质的清除。3.在心肌细胞中Nrf2能够促进自噬小体的形成和自噬流的增加。4.在心肌细胞中Nrf2不影响细胞凋亡但显著抑制细胞坏死。5.Nrf2通过增强自噬介导的泛素化蛋白聚集体的清除从而起到细胞保护作用。