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背景破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2(Osteoclast inhibitory lectin related protein2,OCILRP2)也被称为clr-g,是一种Ⅱ型跨膜蛋白,属于C型凝集素相关(clr)蛋白家族。OCILRP2基因最初被发现在骨质形成中发挥作用,可表达于B细胞,树突状细胞(DC)和活化的T细胞。OCILRP2与配体NKRP1f结合,在T细胞中作为一种共刺激分子促进细胞因子IL-2的分泌和T细胞的增殖。沉默OCILRP2的T淋巴细胞,增殖能力和分泌细胞因子IL-2的水平显著降低。体外阻断OCILRP2受体信号可抑制LPS诱导的树突状细胞的成熟与活化。巨噬细胞是炎症反应中的效应细胞,依靠其强大的免疫识别和清除异物的能力,在维持机体内环境稳定等方面,发挥着强大功能。Toll样受体(TLR)是巨噬细胞表面的一类重要的模式识别受体,其主要成员Toll样受体4(Toll-LikeReceptor4,TLR4)主要分布于巨噬细胞、树突状细胞以及T淋巴细胞等,可以识别革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(LPS),并被其激活,从而启动TLR4信号通路,导致促炎细胞因子和干扰素的产生,从而引起相关炎症反应。本文通过沉默OCILRP2在巨噬细胞中的表达,探讨OCILRP2调节TLR4信号通路对巨噬细胞功能的影响。目的通过沉默OCILRP2基因在小鼠RAW264.7巨噬细胞中的表达,探讨OCILRP2调节TLR4信号通路对巨噬细胞功能的影响。方法设计合成OCILRP2的特异性shRNA序列并构建特异性靶向OCILRP2的shRNA慢病毒载体,沉默OCILRP2在RAW264.7细胞中的表达。Westernblot和RT-qPCR实验验证OCILRP2基因沉默的效果。培养OCILRP2基因沉默的RAW264.7细胞和对照细胞,倒置显微镜下观察细胞形态;粘附实验检测细胞粘附能力;划痕实验、Transwell小室法检测细胞的迁移能力、趋化能力;中性红染色法、流式细胞术检测沉默OCILRP2对巨噬细胞内吞功能的影响;RT-qPCR实验检测巨噬细胞细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平;ELISA试剂盒和RT-qPCR检测巨噬细胞分泌的细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平以及NO的释放;Westernblot检测TLR4信号通路中主要信号分子及相关分子C-Raf、AKT、p44/42、p38、TAK1、IκB-α、p65、IRF3、IRAK4、TBK1的表达和活化水平以及iNOS的表达;Westernblot和激光共聚焦显微镜分析p65的活化。结果Westernblot和RT-qPCR实验结果表明,沉默OCILRP2基因后,RAW264.7巨噬细胞中OCILRP2蛋白和基因表达水平显著低于野生型和对照组细胞(P<0.05)。培养各组细胞,于高倍显微镜下观察发现,沉默组细胞伪足显著减少,多呈圆形,且成簇状生长。粘附实验结果显示,细胞贴壁15min、30min、60min、120min后,沉默组细胞的粘附能力显著低于对照组细胞(P<0.05)。划痕愈合实验结果表明,划痕24h和48h后,沉默组细胞的迁移率明显低于对照组(P<0.05)。Transwell小室法实验结果表明,沉默组穿过小室的细胞数量明显低于对照组(P<0.05);中性红实验结果表明,LPS刺激24h后,沉默OCILRP2的RAW264.7细胞的吞饮能力降低;流式细胞术结果表明,沉默OCILRP2的巨噬细胞的吞噬能力较对照组减弱。ELISA和RT-qPCR实验结果表明,OCILRP2基因沉默组细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平显著低于对照组,同时,NO释放检测实验表明沉默OCILRP2抑制了巨噬细胞分泌NO的能力。Westernblot结果表明,沉默OCILRP2抑制小鼠巨噬细胞中iNOS的表达水平及MyD88非依赖的信号通路中相关信号分子的活化。Westernblot和激光共聚焦显微镜结果也表明,沉默OCILRP2抑制转录因子NF-κB的活化。结论OCILRP2通过调节TLR4信号通路中MyD88非依赖途径影响巨噬细胞的功能。