论文部分内容阅读
目的在大鼠创伤性深静脉血栓形成前、形成高峰期,对TDVT大鼠模型股静脉组织基因芯片检测结果进行分析,重点关注血栓形成高峰期促凝-内皮细胞相关高表达基因LOX-1,在大鼠血细胞中对其进行Real-time PCR检测,研究其在血细胞中的表达情况。方法:第一部分创伤性深静脉血栓形成动物实验数据分析及BLAST同源性比对1.建立大鼠创伤性深静脉血栓模型,依据造模时间和肉眼观察血栓形成状态将150只大鼠分为五组,A组(正常对照组,0h),B组(创伤即刻组,0h),C组(血栓形成前组,2.5h),D组(血栓形成高峰组,24h),E组(血栓不形成组,168h)。2.各组分别选取10只取下股静脉血管,切取长约4~5cm的股静脉及主要属支,采用Trizol法提取总RNA,并进行RNA质检。3.采用Affymetrix Rat230基因表达谱芯片检测,基因芯片数据结果采用倍数变化分析方法(两组间同一基因的Signal log2 ratio比较,上调基因:Log2 Ratio≥1,下调基因:Log2 Ratio≤-1,)筛选出差异表达的基因;4.以“endothelial cell"为检索词在芯片检测数据Excel表格中Gene Symbol(基因符号)查询,并应用倍数变化分析方法(调整参数为Signal Iog2 ratio比较=3或=-3);结合同源性比对,确定内皮细胞相关高表达基因LOX-1为重点关注对象5.通过NCBI GenBank数据库CNKI数据库,将两者的基因序列代入BLAST中进行比较,明确LOX-1在大鼠与人类之间的同源性(序列比对使用MEGA 4.0软件)第二部分Real-time PCR检测大鼠血细胞中LOX-1基因表达变化的研究1.再次建立大鼠创伤性深静脉血栓模型,将100只SD大鼠根据观察时间和血栓形成情况进行如下分组:正常对照组(A组)、血栓形成前组(B组2.5h),血栓形成高峰期血栓形成组(C组24h)和血栓形成高峰期血栓形成组(D组)。2.针对相应时间点,每次采集每只大鼠血液标本5ml,离心获取血清及血细胞标本,采用Trizol法提取血细胞总RNA,并切取股静脉血管。3.对LOX-1进行Real-time PCR检测;对切取的股静脉血管进行组织学观察血栓形成程度。结果1.基因芯片检测LOX-1在TDVT大鼠股静脉组织显示:在B组(创伤即刻组)LOX-1显著差异上调表达(BvsA:10.04),并逐渐升高,C组(血栓形成前组)、D组(血栓形成高峰组)与A组(CvsA:14.78、DvsA:17.13),血栓不形成组(E组)呈轻微上调表达(EvsA:5.45)。2.BLAST比对,LOX-1在大鼠与人类之间的同源性为92.6%,大鼠LOX-1与人类基因具有高度的同源性。3.Real-time PCR检测大鼠TDVT模型血细胞中LOX-1的表达量显示:B组(血栓形成前期组)、C组(血栓形成高峰期血栓形成组)较A组(正常对照组)发生显著差异上调表达(BvsA:8.49、CvsA:14.76),而D组(血栓形成高峰期血栓不形成组)较A组(正常对照组)轻微上调表达(DvsA:3.21)。Real-timePCR检测结果与芯片检测结果变化趋势上基本一致。结论LOX-1在大鼠TDVT形成过程中表达变化呈动态上调趋势(BvsA:8.49、CvsA: 14.76、DvsA:3.21),可能通过调节血小板粘附聚集发挥影响血栓形成。这将是我们以后研究围绕的中心。