基于表面增强拉曼光谱技术的食源性危害因子检测方法研究

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食品安全(Food safety)是食品中不含有或含有安全、可接受范围内的可能影响消费者健康的危害因子。食源性危害因子种类繁多,有生物性、化学性、物理性危害因子,同时也包括具有潜在危害风险的转基因食品。近年来,随着食品种类的日益丰富、食品加工方法以及加工过程的日渐复杂,食品被这些危害因子污染的风险也越来越大,由此引发的公共食品安全问题也日益突出。因此,如何能快速有效的检测出食品中潜在的危害因子,并及时有效地预防食品安全事故的发生对人民的健康与安全意义重大。表面增强拉曼光谱法(Surface enhancement Raman spectroscopy,SERS)由于其检测灵敏度高、操作简便、准确率高、以及无需样品预处理等优点,在食品安全检测研究中的应用越来越频繁。本文主要利用制备的几种常见拉曼基底以及开发的新型膜材质拉曼基底,建立了表面增强拉曼检测方法,对常见的几种具有代表性的食源性危害因子进行了检测:(1)几种表面增强拉曼基底的制备及其研究贵金属纳米粒子如金纳米粒子(AuNPs)、银纳米粒子(AgNPs)由于其特殊的表面特性,是最早被应用于表面增强拉曼研究中的基底材料。但是二者各自有其优缺点,AuNPs比较稳定,但是共振强度不明显;AgNPs拉曼增强效应较强,但其稳定性较差,容易被氧化。基于这种情况,双金属复合材料——银包金核壳结构(Au@Ag),逐渐被应用到表面增强拉曼技术中。本章对比了以上三种粒子的拉曼信号增强效果,发现Au@Ag增强效果最好。这种基底既保持了AuNPs粒径均一、易制备、稳定性好等特点,又结合了银纳米材料拉曼增强效果好的优点,还在AuNPs基础上增大了粒径,是较为理想的基底材料;随着拉曼技术的不断发展,非金属材料SiO2纳米微球由于合成简单,粒径尺寸均一且分布窄,并且粒径大小容易控制,所以常被用来作为拉曼核壳基底材料中的核结构。与传统球状或者核壳拉曼基底相比,银包裹的二氧化硅微球(SiO2@Ag)粒径成倍增大,拉曼增强效应也显著增强;此外,本章还制备了一种新型的基于玻璃纤维膜基质的拉曼基底,成功获得了结晶紫醋酸盐(CVa)和亚甲基蓝(MB)两种信号分子的拉曼光谱图,结合玻纤材质的柔韧性,证明了该基质具有很好的应用潜力。(2)基于巯基吡啶功能化金属纳米粒子的表面增强拉曼光谱一步法检测重金属汞离子常用的汞离子表面增强拉曼检测方法,主要是利用汞离子(Hg2+)与核酸碱基中的胸腺嘧啶(T)之间形成的T-Hg2+-T结构来设计一段短链DNA作为适配体,进而设计成传感器进行检测。这种情况下,需要在基底上同时组装核酸探针和信号分子,操作繁琐。本章建立的检测方法,主要使用4-巯基吡啶(4-MPY)作为拉曼信号分子,修饰在AuNPs表面制备成检测体系,再利用吡啶基团中的N可以通过多价N键与Hg2+配位形成Hg-(吡啶)2络合物的特点,利用4-MPY-Hg-4-MPY的结构将金属纳米粒子聚集到一起,使4-MPY拉曼信号增强,得到4-MPY拉曼信号与Hg2+浓度之间的正相关关系,实现Hg2+的定量检测;此外,对AuNPs和Au@Ag核壳结构两种基质制备的体系检测灵敏度进行了比较,发现Au@Ag核壳结构制备的体系具有更好的拉曼增强效应,提高了检测灵敏度。(3)基于核壳基底侵蚀的表面增强拉曼光谱法对亚硝酸盐的检测亚硝酸盐是食品中常用的添加剂,可以有效防止食品中细菌生长和食品的氧化,所以常被用作食品防腐剂使用。蔬菜腌制过程中、或者剩菜放置太久富集的硝酸盐会在发酵过程中会被还原为亚硝酸盐。亚硝酸盐进入人体血液中,容易引起组织缺氧中毒甚至死亡,还可能诱发肿瘤致癌。本章内容主要在银材质为壳结构的核壳纳米粒子表面先修饰拉曼信号分子罗丹明6G(Rho-6G),该体系原始状态下就具有较强的拉曼信号。之后利用亚硝酸根离子(NO2-)在酸性条件下具有温和氧化性的特点,将核壳结构表面银壳侵蚀掉,使拉曼体系拉曼增强效应降低,建立了Rho-6G信号强度与NO2-之间的负相关关系,实现了对于亚硝酸盐的定量检测;此外还对比了AuNPs和SiO2分别作为拉曼基底核结构的检测灵敏度,验证出SiO2@Ag核壳结构体系检测灵敏度更高。(4)基于玻璃纤维膜基质的表面增强拉曼光谱法快速检测虾类产品中结晶紫的残留鱼虾类水产品以及蔬菜瓜果中经常会因为保鲜或者避免病虫害等原因存在药物残留。传统的检测方法在取样制样后会对样品中存在的药物进行一定程度的稀释,如若检测方法灵敏度受限,很可能得到假阴性,影响检测结果。并且,一些制样方法操作繁琐,耗时较长,影响时效性。针对这种情况,本章制备了一种新型的拉曼基底,以玻璃纤维膜为基质,在其上原位生长银纳米粒子,得到了柔软性较好、均一性优良的膜材质拉曼基底。这种基底方便在固体样本表面取样,并且不会造成样品中分析物浓度的损失,浓度低到f M级别的分析物也能检测出来;利用制备的新型膜材质基底,成功检测出了虾样本中的CVa含量;此外,利用该基质也并不影响液体样本的检测,可直接滴加到基底上面或者通过浸泡吸附到基底,具有较为广泛的应用范围。(5)借助体外核酸等温扩增的表面增强拉曼光谱法超灵敏检测副溶血弧菌副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus,VP)又称肠炎弧菌,人体感染VP后容易导致腹部不适,并伴有恶心、呕吐和腹泻等不良症状,严重腹泻还可导致脱水,甚至出现神志意识障碍。本章应用了VP的适配体与特异性抗体,构建了借助核酸等温扩增的表面增强拉曼检测方法,实现了对VP的超灵敏检测。首先,将VP抗体固定到孔板中,含有VP适配体序列的核酸作为核酸滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)的引物先在体外进行扩增。再待测样中有VP存在时,以VP作为媒介将RCA扩增产物捕获到孔板中。之后通过核酸碱基互补配对,将修饰了扩增产物中重复序列互补DNA的Au@Ag也随之固定在孔板中,形成了SERS底物。所以,待测体系中VP含量越高,拉曼信号强度越高。利用建立的方法,在菌浓度为2.2×102~2.2×108时,实现了对VP的定量检测,检测限达到1 cfu/m L,并且该方法对VP有良好的选择性。(6)基于表面增强拉曼光谱解码的侧向层析试纸同时鉴定转基因食品各组分转基因食品作为一种特殊的存在,它的安全性尚未有明确结论,一直存在很大的争议。因此,建立对转基因食品的准确筛查方法很有必要。本章是将侧向层析试纸(Lateral flow strip,LFS)技术与SERS相结合,成功构建了基于表面增强拉曼解码的侧向层析试纸传感器,可同时快速检测转基因各组分。以转基因大豆作为研究对象,利用了三个拉曼信标,实现了转基因大豆中三种组分(启动子、密码子、终止子)的精准区分;利用拉曼特征峰峰型尖锐而且窄的特点,能够在LFS传感器上同一条测试线(T线)实现多重检测,在保留了传统试纸测试简便的特点前提下,实现了无交叉影响的多重检测,并且有较好的特异性,单碱基错配的短链核酸也能够区分。
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