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当归作为中医临床“补血、活血"要药已有数千年的应用历史。我们既往研究表明:1.当归多糖(Angelica polysaccharides,APS)是当归中促进血细胞发生的有效成分;2.在有外源性造血生长因子(Epo,GM-CSF,IL-3等)存在的条件下,APS对正常或贫血小鼠的髓系造血祖细胞(BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-MK)有显著促进增殖分化的作用;3.APS在体外可促进人红系、粒单系及混合系造血祖细胞的增殖与分化,具有协同造血生长因子促进血细胞生成的作用。APS既能促进正常血细胞的发生,又能抑制白血病细胞增殖并诱导其向红系、粒系细胞等方向分化,提示APS具有双向调控作用,但其具体的分子生物学机制不清。近年来研究表明,造血生长因子介导JAKs/STATs(jarias activatedkinase/signal transducer and activator of transcription)信号通路是多种细胞因子调控细胞增殖、分化、凋亡的关键途径。STAT5是STATs家族的重要成员,在正常血细胞发生和白血病细胞的增殖分化中,红细胞生成素(Epo)介导的JAK2/STAT5信号转导通路起着极为重要作用,作为Epo-Epo-R下游分子,JAK2/STAT5对原始造血干/祖细胞的维持和扩增是必需的。JAK/STATs通路的异常激活与白血病的发生密切相关,白血病细胞系和原代白血病细胞中,存在高水平的STAT3激活,它促进肿瘤细胞的增殖,抑制正常的凋亡过程。越来越多的研究已证明STAT3信号途径是多种有效的肿瘤干预治疗的分子标靶,STAT3靶向治疗已成为目前肿瘤治疗领域研究的热点之一。从祖国医学宝库中寻找出既能促进正常造血、又能抑制白血病细胞恶性增殖,并诱导其向成熟方向分化的天然诱导分化剂已成为治疗白血病的希望和重要途径。本研究分为两个部分进行试验:1.当归多糖对K562白血病细胞JAK2、STAT3表达和活化的影响;2.当归多糖协同Epo对脐血造血细胞JAK2/STAT5信号传导通路的影响。本课题旨在从信号传导角度探讨APS即能促进正常造血又能抑制白血病细胞增殖并诱导分化的双向调控机制,并为进一步开发和利用当归多糖提供实验依据。一、当归多糖对K562白血病细胞JAK2、STAT3表达和活化的影响目的:探讨当归多糖对K562白血病细胞JAK2、STAT3表达和活化的影响,阐述当归多糖抑制白血病细胞增殖、促进分化与凋亡的信号调控机制。方法:1.实验分组:对照组,常规培养;APS组,常规培养基础上加入APS(200 mg/L),分别培养12、24、36、48、72和96h,收集各组细胞进行以下研究。2.免疫细胞化学检测STAT3的表达。3.激光共聚焦扫描显微镜观察STAT3的表达4.Western blotting法检测JAK2、STAT3、Phospho-STAT3的表达。结果:1.APS作用K562细胞12h,胞核中STAT3表达较对照组明显减少,而胞质内的表达明显增多;2.APS作用72h,细胞核内STAT3表达比对照组减少,但胞质内的表达差异不显著。3.免疫印迹法显示APS作用K562细胞12、24、36、48h,胞质中STAT3表达增多,核中STAT3表达较对照组减少;4.免疫印迹法显示APS作用K562细胞后,STAT3酸化水平较对照组降低一直持续到96 h,JAK2的表达均无显著变化。结论:APS能抑制K562细胞STAT3的表达水平和核转位活化,从而抑制了肿瘤细胞的增殖,促进了凋亡。APS有可能成为抑制白血病细胞增殖、促进其凋亡并诱导其向成熟方向分化的天然诱导剂,具有深入研究的理论价值和广阔的临床应用前景。二、当归多糖协同Epo对脐血造血细胞JAK2/STAT5信号传导通路的影响。目的:探讨当归多糖(APS)调控造血干细胞向红系血细胞增殖分化相关的细胞内JAK2/STAT5信号传导通路,阐述当归“补血、活血”调控血细胞发生的信号传导机制。方法:1.分离纯化胎儿脐带血单个核细胞,在常规体外培养体系加入APS(200μg/ml)作用细胞24h,Epo分别刺激0、2、5、30 min;2.免疫细胞化学与激光共聚焦显微镜观察细胞STAT5的表达;3.Western-blotting-增强化学发光法检测细胞JAK2与浆和核中STAT5的表达。结果:1.APS能协同Epo影响STAT5的表达,对照组与APS组在4个时间点STAT5的表达水平有显著差异;2.各时间点JAK2、细胞浆和核中STAT5表达较对照组显著增加,且在Epo刺激5min时表达最强。结论:APS能协同Epo促进造血细胞增殖分化,其机制与其影响细胞内的JAK2/STAT5信号传导通路有密切相关。综上所述,APS既能抑制K562白血病细胞增殖与分化,又能促进正常血细胞的增殖分化与其对JAK/STATs信号传导通路的影响密切相关。这可能是APS调控血细胞发生的双向调控机制之一,本研究为开发白血病的天然诱导剂和促进造血干细胞增殖分化的天然中药有效成分提供实验依据。