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背景:甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是一类常见的精神兴奋性药物,长期滥用会导致神经系统发生严重且不可避免的损伤性改变。大量研究表明,METH可诱导神经细胞毒性损伤,包括凋亡、自噬等。但其诱导神经元损伤的准确机制仍不明确。近年研究发现,环状RNA(circular RNA,circRNA)参与神经系统疾病的调控。然而,目前circRNA在METH致神经毒性的病理过程中的作用及机制研究还相对薄弱。目的:检测METH诱导原代脑皮层神经元损伤中的circRNA表达谱变化;筛选潜在的参与调控METH神经毒性过程的circRNA,预测差异表达circRNA的生物学功能;探究位于其下游的基因变化,及它们与成瘾行为之间的联系。方法:(1)METH损伤原代脑皮层神经元后的circRNA表达谱分析结果:培养新生鼠脑皮层神经元并使用合适浓度的METH进行处理并提取样本;应用高通量转录组测序技术检测METH处理后的circRNA表达谱变化;对差异表达的circRNA关联的基因进行GO分析及KEGG分析,并构建聚类分析及火山图分析寻找差异表达的circRNA;利用qRT-PCR对候选的circRNA进行表达验证。(2)差异表达显著的circHomer1的功能分析:参考测序结果、验证表达差异倍数及生物信息学分析结果,筛选出circHomer1并在HT-22小鼠海马神经元细胞系中进行后续实验。运用UCSC网站对circHomer1的生物结构进行分析,并对其PCR产物进行测序明确circHomer1的反向剪接位点,从而验证其环状结构。依据反向剪接位点设计小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)用于降调circHomer1表达,应用Annexin V-FITC/PI进行流式细胞术以及cleaved Caspase3蛋白免疫印迹分析探究敲低circHomer1对METH毒性作用的影响。(3)circHomer1的下游基因Bbc3的功能分析:利用TargetScan及starBase对circHomer1下游miRNA及靶基因进行预测,通过qRT-PCR及蛋白印迹分析预测的靶基因与circHomer1的关系。设计siRNAs降调下游靶基因Bbc3,利用CCK-8、ROS染色及Hoechst/PI染色探究Bbc3参与调控METH的神经毒性的作用。(4)成瘾模型鼠脑内显著表达circRNA检测以及CPP相关性分析:利用黑白箱及CPP(conditioned place preference)试验构建METH依赖小鼠动物模型,取材海马(Hp)、伏隔核(NAc)、腹侧被盖区(VTA)及前额叶皮质(pFC)脑区并对circHomer1、circTlk1表达量进行检测;对circHomer1、Bbc3表达量与行为学指标之间的关系进行相关性分析。结果:(1)METH损伤原代脑皮层神经元后的circRNA表达谱分析结果:培养小鼠原代脑皮层神经元,通过MTT实验选定METH损伤浓度为2mM。应用高通量测序技术,我们共获得2458个外显子来源的circRNA,其中差异表达的circRNA共163个(上调表达119个,下调表达44个),并发现circRNA长度多小于2000核苷酸。我们对测序数据进行GO及KEGG分析预测其参与的分子通路及生物学功能,发现在CC(cellular component)分类下其主要富集于“dendritic shaft”条目,在 pathway 分析中发现主要富集于“morphine addiction",显示富集的分子通路与成瘾相关。同时,我们进行聚类分析及火山图分析,通过设定阈值(差异倍数>1.5,p<0.05)筛选了具有潜在生物学功能的8个circRNA(Whsc1,Homer1,Lin54,Tlk1,Slc8a1,Gpr137c,Rapgef6 以及 Ankrd11),经qRT-PCR验证,发现circHomer1在METH处理后表达上调显著。(2)circHomer1的功能分析结果:筛选表达差异显著的circHomer1进行后续研究,发现METH损伤后,circHomer1在原代脑皮层神经元与HT-22细胞中表达均显著上调。对circHomer1的PCR产物进行分析,可以发现其中包含反向剪接位点,并且在RNase R消化实验中发现circHomer1具有较强的稳定性。利用Cy3标记的FISH探针定位circHomer1,我们发现其主要分布于细胞质中。而针对circHomer1的反向剪接位点设计的两条小干扰RNA均能有效敲低circHomer1,并且在敲低circHomer1后可有效降低流式检测中的细胞凋亡率以及cleaved Caspase3蛋白表达水平,表明circHomer1在METH导致的神经元损伤中发挥了重要的作用。(3)作为circHomer1的下游基因,Bbc3参与METH致神经元毒性损伤的功能分析结果:通过预测我们发现Bbc3可能为circHomer1的下游基因,且在METH处理后Bbc3的表达水平明显升高。敲低circHomer1后,Bbc3的mRNA及蛋白水平均有所下调。而抑制Bbc3表达后可明显减少METH诱导的PI阳性细胞数,并可明显降低ROS检测中的荧光强度,从而提高细胞存活率,表明Bbc3作为circHomer1的下游分子参与了 METH导致的神经元损伤过程。(4)在METH依赖小鼠脑内circHomer1表达显著上调,且与CPP分数密切相关:我们利用CPP试验成功构建了小鼠成瘾模型,在其海马(Hp)、伏隔核(NAc)、腹侧被盖区(VTA)及前额叶皮质(pFC)四个脑区中发现circHomer1均呈上调表达,且在Hp中表达显著;而circTlk1仅在VTA中呈下调表达,而在其他三个脑区呈上调表达改变。随后,通过Pearson’s相关分析我们发现circHomer1、Bbc3的表达量与CPP分数三者之间存在一定的相关性。结论:本项研究中,通过高通量测序揭示了 METH诱导原代神经元损伤中circRNA表达谱变化,并筛选了差异表达的环状RNA circHomer1。通过功能分析发现,敲低circHomer1可下调Bbc3表达减轻METH诱导的神经元损伤。并且,circHomer1及Bbc3的表达与METH依赖小鼠成瘾偏好间存在一定联系。总之,circHomer1/Bbc3可能参与了 METH致神经元毒性损伤的过程。