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清开灵注射液具有清热解毒、化痰通络、镇静安神和醒脑开窍的功效,在临床上使用广泛。但随着临床应用日益增多,清开灵注射液的不良反应报告也逐渐增加,不良反应主要表现为用药30min内即可发生药物热、皮肤反应或过敏性休克,其中重症过敏反应严重限制了清开灵注射液的临床应用。因此,找出清开灵注射液中致重症过敏反应的主要物质,是保障清开灵注射液安全使用的关键。目前,国内学者对清开灵注射液致类过敏反应研究较为透彻,初步发现了栀子、金银花提取物和胆酸可能是引起类过敏反应的物质；而清开灵注射液致IgE介导的过敏反应仍处于初级阶段,仅仅建立了一些简单的BN大鼠速发过敏模型；不少学者通过碳二亚胺法制备绿原酸完全抗原,发现绿原酸可能可以作为一种半抗原引发免疫应答,还有不少学者则认为绿原酸并非半抗原,而是其中的杂质物-异绿原酸为半抗原,显然,仅有一种偶联方法并不足以说明绿原酸具有变应原性。因此,本研究拟对清开灵注射液致IgE介导的过敏反应动物模型进行深入研究,并利用建立此模型的技术路线对具有争议性的绿原酸进行变应原性验证研究,为筛查出清开灵注射液中致重症过敏反应的主要物质、保障清开灵注射液安全使用奠定基础。目的：1建立清开灵注射液致Balb/c小鼠IgE介导的过敏反应模型,为后续筛查清开灵注射液中致重症过敏反应的主要物质奠定基础。2利用建立IgE介导的过敏反应动物模型的技术路线对绿原酸进行变应原性研究。方法：1清开灵注射液致Balb/c小鼠IgE介导的过敏反应模型的建立(1)阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)的制备及鉴定：将牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相关合成方法制备cBSA,然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化,同时辅以紫外分光光度法(UV-Vis)和红外光谱法(FT-IR)进行鉴定。(2)清开灵-cBSA完全抗原的制备及鉴定：利用Mannich反应将清开灵注射液冻干粉偶联至cBSA上制备完全抗原,然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化,同时辅以UV-Vis和FT-IR进行鉴定。(3)清开灵-cBSA完全抗原刺激Balb/c小鼠实验：将18只Balb/c小鼠随机分成3组：清开灵-cBSA偶联物+铝佐剂(实验组),OVA+铝佐剂组(阳性对照组),生理盐水组(阴性对照组)。实验组多点皮下注射0.3mL偶联物与佐剂的混合物(含0.05mg偶联物),其他组以等剂量多点皮下注射。在初次免疫后第14d、21d、28d、35d,以相同剂量皮下注射加强免疫,每次加强免疫后30min内观察小鼠体征表现,参照相关标准进行评分统计,同时眼后眦静脉采血约0.5ml,分离出来的血清-20℃储藏,用于血清中组胺和总IgE的含量测定。第35d取实验组、生理盐水组小鼠全血并解剖,将肺组织置于10%的甲醛中,用于病理切片检查。(4)小鼠血清中总IgE、组胺的含量测定：将各时间点的小鼠血清按照试剂盒说明书进行IgE、组胺含量测定,然后采用One-Way ANOVA方法,比较不同组别间是否有差异。(5)小鼠肺部组织病理切片观察：将肺组织用10%甲醛固定,然后包埋于石蜡中,切片成5μl厚,再用H&E染色,最后置于100X电镜下拍照。2绿原酸变应原性研究(1)阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)的制备及鉴定：将牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相关合成方法制备cBSA,然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化,同时辅以UV-Vis、FT-IR和基质辅助-激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法进行鉴定。(2)绿原酸-cBSA完全抗原的制备及鉴定：利用Mannich反应将绿原酸偶联至cBSA上制备完全抗原,然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化,同时辅以UV-Vis、FT-IR和MALDI-TOF-MS法进行鉴定。(3)绿原酸-cBSA完全抗原刺激Balb/c小鼠实验：将6只Balb/c小鼠随机分成2组：偶联物1、偶联物2组。实验组多点皮下注射0.3mL偶联物与铝佐剂的混合物(含0.1mg偶联物)。在初次免疫后每隔2周以相同剂量皮下注射加强免疫,每次加强免疫后30min内观察小鼠体征表现,进行评分统计；实验组初免前1d静脉后眼眶采血0.5m1作阴性对照,第三次加强免疫后取全血；采集的血先室温静置30min,然后4℃,2000rmp离心10min,分离出来的血清-20℃储藏,用于抗血清的效价测定。(4)小鼠抗血清效价测定：包被96孔酶标板,4℃孵育过夜；用含1%nBSA的PBS溶液于37℃封闭,加入不同稀释度的抗血清,37℃孵育,加入羊抗鼠酶标抗体,37℃孵育,加TMB双液,于37℃反应20min,然后加终止液,用酶标仪读出各孔在450nm处的吸光度值。阴性对照用未免疫过的小鼠血清,空白对照为PBS。每一稀释比的供试品设置3个平行孔。血清供试品的A450nm值(P)与阴性对照的A450nm值(N)之比(P/N)大于2即为阳性,反之则为阴性,以P/N大于2的血清最高稀释倍数作为抗体的效价。结果：1清开灵注射液致Balb/c小鼠IgE介导的过敏反应模型建立通过对nBSA进行阳离子化修饰,应用Mannich反应制备清开灵-cBSA完全抗原,阳离子交换法分离纯化,并利用UV-Vis、FT-IR对其进行鉴定,鉴定结果表明清开灵-cBSA偶联成功；用清开灵-cBSA偶联物刺激小鼠后,小鼠出现瘙痒、立毛、扭体等过敏体征；与阴性对照组比较,实验组小鼠各个时间点的血清中总IgE、组胺含量均升高(P<0.01,P<0.05)；与阳性对照组比较,实验组小鼠各个时间点的血清中总IgE、组胺含量并无显著性差异(P>0.05)；肺部组织病理切片显示肺部受到明显损伤：肺泡融合、中性粒细胞浸润、肺部充血、气管壁有轻度破损；以上各项指标都说明清开灵-cBSA完全抗原成功使Balb/c小鼠发生IgE介导的过敏反应,模型建立成功。2绿原酸变应原性研究通过对nBSA进行阳离子化修饰,应用Mannich反应制备绿原酸-cBSA完全抗原,阳离子交换法分离纯化,并利用UV-Vis、FT-IR和MALDI-TOF-MS法对其进行鉴定,三种鉴定结果均表明绿原酸-cBSA偶联成功；用清开灵-cBSA偶联物刺激小鼠后,小鼠出现瘙痒、立毛、扭体等过敏体征；同时,两实验组小鼠均成功获得了针对特异性绿原酸的抗血清,且效价均为1：4000。结论：通过将(?)BSA进行修饰,然后利用Mannich反应制备清开灵-cBSA完全抗原,受刺激后的小鼠出现瘙痒、立毛、扭体等过敏体征,血清总IgE、组胺升高,肺部病理切片显示肺泡融合、充血、气管壁破损,说明清开灵-cBSA完全抗原成功使Balb/c小鼠发生IgE介导的过敏反应,利用该技术路线建立清开灵注射致Balb/c小鼠IgE介导的过敏反应模型是可行的。同时,利用该技术路线成功制备绿原酸-cBSA完全抗原,并获得了高效价的抗血清,更进一步说明了绿原酸可作为半抗原引发免疫应答产生特异性抗体,具有变应原性。