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目的:特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性、进展性、不可逆且病因不明的肺部疾病,伴随着肺部间质炎症和组织病理学的改变,由肺部原位成纤维细胞分化而来的肌成纤维细胞是其主要的效应细胞。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的高表达和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)如纤维连接蛋白fibronectin和胶原纤维的异常沉积被认为是肌成纤维细胞的特有标志。Sirtuin 6(SIRT6)是sirtuin家族成员之一,具有NAD~+依赖的组蛋白去乙酰化酶活性,参与调节DNA损伤修复、炎症反应、肿瘤以及寿命等。我们前期研究表明SIRT6可以抑制IPF进程中的上皮间质转化过程。然而,SIRT6在肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用尚无报道。本研究以人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast,HFL1)为对象,研究SIRT6在HFL1细胞表型转化中的作用以及可能存在的分子机制,为寻找IPF有效的治疗靶点提供理论依据。方法:采用Western blot检测不同浓度(1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml和15 ng/ml)的转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理HFL1细胞24 h,以及5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞不同时间(6 h、12 h、24 h、48 h和72 h)后SIRT6蛋白表达水平。使用腺病毒过表达和shRNA沉默SIRT6后无血清处理HFL1细胞12 h,再用5 ng/ml TGF-β1处理细胞24 h,采用Western blot检测α-SMA、Collagen I、fibronectin和SIRT6蛋白表达水平。腺病毒过表达野生型和突变型SIRT6后无血清处理HFL1细胞12 h,再用5 ng/ml TGF-β1处理细胞30min,采用Western blot检测p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平,激光共聚焦扫描显微镜观察Smad2核转运的改变;5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min和60 min,采用免疫共沉淀检测SIRT6与NF-κB p65蛋白结合情况。腺病毒过表达野生型和突变型SIRT6后无血清处理12 h,5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h,采用双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB的转录活性,实时荧光定量PCR检测NF-κB靶基因IL-1β、IL-6、MMP9的表达水平。结果:1.TGF-β1对HFL1细胞中SIRT6蛋白表达的影响:与对照组相比,2ng/ml和5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h后SIRT6蛋白表达水平显著上调(P<0.05),且浓度为5 ng/ml时达到最高水平。时间-效应关系实验表明5 ng/ml TGF-β1处理细胞12 h和24 h后SIRT6蛋白表达水平显著增加(P<0.05或P<0.01),且24 h时达到最高水平。2.过表达和沉默SIRT6对肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响:5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞24 h后α-SMA,collagen I和fibronectin蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。过表达SIRT6后显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA,collagen I和fibronectin蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。但是沉默SIRT6后仅显著增加TGF-β1诱导的fibronectin蛋白的表达水平(P<0.05),α-SMA和collagen I蛋白表达没有改变。仅过表达或沉默SIRT6对HFL1细胞表型转化没有作用。3.过表达SIRT6对TGF-β1/Smad2通路的作用:5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min后p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平显著上调。过表达SIRT6可显著抑制TGF-β1诱导p-Smad2蛋白表达水平(P<0.01),但对p-Smad3蛋白表达没有作用。无去乙酰化酶活性突变体SIRT6(H133Y)未能减弱TGF-β1诱导的p-Smad2蛋白表达水平。过表达野生型SIRT6显著抑制TGF-β1诱导的Smad2蛋白核转运,但突变体H133Y无此作用。4.过表达SIRT6对NF-κB通路的作用:SIRT6与p65相结合,并在5 ng/ml TGF-β1处理HFL1细胞30 min后增强。过表达野生型SIRT6而非突变体H133Y显著抑制TGF-β1诱导的NF-κB转录活性(P<0.01),以及NF-κB靶基因IL-1β、IL-6、MMP9的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:TGF-β1处理HFL1细胞后,SIRT6蛋白表达呈现出一定的剂量和时间效应关系。过表达SIRT6通过抑制TGF-β1/Smad2和NF-κB信号通路削弱TGF-β1诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,且依赖于SIRT6的去乙酰化酶活性。