宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，虽然对其发病机制已经进行了大量的临床和实验研究，但目前其病因学分子机制并不完全清楚。有研究证实，正常宫颈组织中存在Cx26、Cx43的表达，而宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中间隙连接蛋白表达下降甚至缺失，宫颈癌细胞系HeLa中存在多种Cx基因缺失，Cx26、43的表达与宫颈癌的恶性程度呈负相关。宫颈癌细胞中多种间隙连接蛋白的缺失，以及导致间隙连接通讯的中断可能是肿瘤细胞逃避细胞分化监控的机制之一。 细胞间隙连接是普遍存在于动物组织中的一种细胞连接形式，是由间隙连接蛋白所形成的六聚体跨膜蛋白通道结构，是细胞间交换信息离子和小分子物质的唯一通道，这种物质和信息的交流称为细胞间隙连接通讯(GJIC)。 细胞间隙连接通讯调控细胞的新陈代谢、增殖和分化等生理过程，对机体的代谢平衡及生长发育有重要意义。其功能异常与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关。大多数肿瘤细胞与非肿瘤细胞相比，间隙连接通道减少，间隙 第四军医大学博士学位论文连接蛋白表达下降。 近年的研究认为，间隙连接基因家族是一抑癌基因家族，其抑制肿瘤细胞生长的作用机理是复杂的，有研究表明，它可能既是GJ工C的调节剂，又可以不依赖于GJIC的方式而调控细胞生长。研究目的: 本实验通过研究宫颈癌细胞基因组中间隙连接基因的表达及对细胞间通讯功能的直接影响，检测细胞内信号分子的变化，分析其信号转导调控机制，为深入阐明子宫颈癌病因学分子机制及探讨可能的基因治疗途径提供可靠的实验依据。研究方法:l应用RT一PCR方法、Western blot和流式细胞仪，分析 正常子宫颈组织及宫颈癌细胞中Cx26、Cx43的表达情 况。2利用基因重组技术，获得Cx26，Cx43基因全长片段， 并构建其真核表达载体，通过脂质体方法将Cx基因转 染至宫颈癌细胞系HeLa中，应用RT一PCR检测细胞内基 因变化。3应用免疫组织化学方法、激光扫描共聚焦显微镜分析技 术、流式细胞技术，定性、定量分析转染细胞中两种蛋 白的表达情况，经MTT方法和细胞周期检测观察Cx基 因转染对细胞的生长增殖的影响。4应用外源性维甲酸以时间剂量依赖方式刺激细胞，观察 肿瘤分化诱导剂维甲酸对细胞的作用情况，利用细胞划 痕标记荧光传输技术，观察细胞间隙连接通讯恢复情 况，激光扫描共聚焦显微镜，定位和定l分析转染细胞 第四军医大学博士学位论文 胞质内第二信使一游离[Ca，‘」，浓度变化。western blot 分析，检测转染细胞内Cx蛋白酪氨酸磷酸化状态，以 及活性Raf一1、ERK表达情况，分析可能的信号转导途 径。研究结果:1在宫颈组织中Cx26，Cx43基因、蛋白表达阳性，而宫 颈癌细胞中表达阴性。2宫颈癌细胞系HeLa经过Cx26，Cx43基因转染后，RT一PCR 方法检测发现细胞内Cx26，Cx43基因阳性。3用免疫化学法检测发现，转染细胞内Cx26、Cx43蛋白 的表达阳性，在细胞膜及细胞浆处两种蛋白均存在表 达。4激光扫描共聚焦显微镜分析技术，发现两种蛋白在绝大 部分细胞内呈共表达状态，表达位于细胞膜和细胞质 中。5流式细胞技术测定转染细内Cx26、C、43蛋白的表达量， 发现两种蛋白的表达分别为96.46%、96.84%。6 MTT方法进行细胞生长动力学分析，发现转染细胞在接 种第二天起，出现增殖明显减慢。7细胞周期检测发现转染细胞Gl期细胞比例明显下降， S十GZ期细胞比例上升，细胞增殖受阻。8外源性维甲酸以时间剂量依赖方式刺激细胞，发现转染 细胞生长速度明显减慢，并存在时间剂量依赖性。随时 间的延长和剂量的加大抑制作用增强。9 Luciferyellow划痕标记荧光传‘输试验，结合荧光显微 镜分析技术，检测转染细胞间隙连接通讯功能，发现转 染细胞间荧光传输增加，维甲酸刺激能加强细胞间这种 传输能力。 第四军医大学博士学位论文10通过Flu。一3 AM负载，激光扫描共聚焦显微镜分析细胞 静息状态下细胞内游离〔CaZ‘〕【，未转染细胞为47.3，转 染细胞为38.6，经维甲酸刺激后，未转染细胞为31.3， 转染细胞为18.5。11 Western blot分析，发现转染细胞内存在Cx26、Cx43 蛋白，且Cx43蛋白表现出明显的酪氨酸磷酸化状态， 维甲酸刺激后，酪氨酸磷酸化Cx43蛋白水平升高。而 Cx26蛋白没有酪氨酸磷酸化现象。12经维甲酸刺激后Raf一1、ERK呈现活性状态。研究结论:1在正常宫颈组织中存在Cx26、Cx43基因蛋白的表达， 而宫颈癌细胞HeLa中表达缺失。2Cx26、Cx43基因转染使HeLa细胞内呈现Cx26、Cx43基 因蛋白的表达，使细胞间建立功能性间隙通讯。抑制 HeLa细胞的生长，使细胞停留在Gl期。3外源性维甲酸的刺激，能增强转染细胞的生长抑制，并 呈现时间剂量依赖性。4外源性维甲酸的刺激，能增强细胞间隙通讯能力，使细 胞内钙离子浓度明显下降，提?