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近年来研究发现,间隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)的表达与皮肤伤口愈合关系密切。皮肤创伤后,伤口内部及其周围组织中Cx43的表达瞬时下调,可以加快皮肤伤口愈合的速率,提高伤口愈合的质量。参与皮肤伤口修复的细胞主要有三种:成纤维细胞、角质形成细胞和血管内皮细胞。有关Cx43与伤口愈合分子机制的研究表明:Cx43表达下调可以加快成纤维细胞、角质形成细胞的迁移速率,提高成纤维细胞和角化形成细胞增殖能力及角化细胞的分化能力。但Cx43是否影响血管内皮细胞的功能尚不清楚。已知血管内皮细胞会参与皮肤伤口愈合的整个过程。在炎症阶段,白细胞需要渗漏穿过毛细血管内皮层,到达创伤部位引发炎症反应。而在增殖阶段,血管内皮细胞是伤口处血管新生的主要细胞,新生血管可以为伤口区域细胞的迁移、增殖提供氧气和营养物质。基于血管内皮细胞对伤口愈合的重要性,本文研究分析Cx43下调对于血管内皮细胞功能的影响。人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)是最常用的血管内皮细胞模型,而且它对包括炎症因子在内的多种体内因子均具有良好的反应性。因此,本文选择HUVECs作为体外研究模型。小干扰RNA(si RNA)能够特异性减少蛋白在细胞中的表达。根据Cx43基因序列,本课题组设计了三种si RNA序列(Cx43 si RNA 1,Cx43 si RNA 2,Cx43si RNA 3)。通过Western blot实验筛选沉默效果最佳的si RNA序列及si RNA最佳作用时间,结果表明si RNA作用HUVECs 24 h后,Cx43沉默效率达到最大,并有效维持最佳沉默效果达72 h以上。三种序列中,Cx43 si RNA 1沉默效果最佳,作用24 h时,即可使HUVECs内Cx43的表达降低约80%。因此,本课题选择Cx43 si RNA 1作为特异性减少Cx43的si RNA序列,作用24 h作为最佳作用时间,研究Cx43的表达下调对HUVECs细胞间通讯、增殖、迁移、以及血管生成活性的影响。实验结果表明HUVECs中Cx43蛋白表达下调后,HUVECs细胞间信号传递功能减少约65%,细胞活力、增殖和迁移活性显著降低、血管生成速度减缓。炎症阶段是影响创伤愈合速率和质量的重要阶段。炎症反应的发生需要经历白细胞贴壁、粘附、穿越血管内皮细胞层的过程。白细胞与内皮细胞之间的粘着及白细胞渗出内皮细胞层是炎症反应的必经阶段。因此,本课题继续研究HUVECs中Cx43下调,对单核细胞U937与HUVEC之间粘着,以及U937穿过HUVECs细胞层能力的影响。肿瘤坏死因子α(TNF-α)可以刺激HUVECs呈现炎症状态,因此,本文使用TNF-α刺激HUVECs,以模拟体内炎症状态。Calcein-AM标记U937法及活细胞虎红染色法实验结果表明,TNF-α刺激HUVECs后,HUVECs对U937的粘附能力增加,HUVECs确实能够达到炎症状态。HUVECs中Cx43蛋白下调后,U937与HUVEC之间的粘附能力明显降低。filter inserts实验结果表明U937迁移穿过HUVECs细胞层的数目减少。本课题进一步进行分子机制研究。已知粘着分子在白细胞与内皮细胞的粘附过程中起到至关重要的重要,本研究通过Western blot及rt-PCR分析HUVECs中Cx43下调对粘着分子表达的影响,发现Cx43蛋白下调后,HUVECs中粘附分子细胞间粘附分子(ICAM-1)、血管粘附分子(VCAM-1)表达下调,而CD44表达基本没有变化。以上的研究表明,伤口处Cx43表达下调,会通过影响血管内皮细胞生物学特性,包括降低细胞间隙连接交流、增殖、迁移、血管形成能力,以及通过降低血管内皮细胞中粘附分子的表达,减少白细胞与血管内皮细胞的粘附,进而降低炎症反应的强度,提高伤口愈合速率、改善伤口愈合质量。