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目的：通过细胞膜表面分子-指数富集的配基系统进化技术(The cell surface-systematic evolution of ligands by exponential enrichment,CS-SELEX)筛选获得特异性和高亲合力结合丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)E2包膜糖蛋白的ssDNA适配子(apatmers);检测和分析所筛选的HCV-E2适配子的序列和构象；适配子与靶分子的结合以及对细胞的毒性等特性；从分子、细胞和临床水平验证HCV-E2适配子的诊断和抑制HCV的生物学功能；探讨E2适配子与靶分子结合的机理。方法：本研究运用CS-SELEX技术对CT26细胞上表达的HCV-E2糖蛋白(E2-CT26)进行筛选,并用CT26细胞进行反筛。我们首先构建一个长度为88nt含有30个随机序列的单链DNA(ssDNA)文库(库容量约为1015),PCR扩增为双链DNA随机文库后,作为初始模板保存dsDNA(97bp=88bp+引物序列),用不对称PCR扩增出每轮筛选的ssDNA库作为下一轮筛选适配子。经14轮筛选后,流式细胞仪(FCM)检测和比较阳性细胞吸附各轮筛选所得适配子库的能力大小。将吸附能力最大的适配子库克隆到pUC19质粒中送生物公司进行测序,并利用DNAMAN软件对所测定的序列进行序列一级结构和二级结构分析及同源性比较。毛细管电泳(CEMSA)、流式细胞仪(FCM)和免疫荧光共聚焦显微镜(CONFOCAL)确认适配子与E2-CT26细胞上所表达的HCV-E2糖蛋白的结合；FCM检测适配子抑制HCV-E2蛋白与人肝癌细胞Huh7.5.1的结合；并且运用噻唑蓝比色法(MTT)测定HCV-E2单适配子ZE18对肝癌细胞Huh7.5.1的毒性作用；计算适配子库和单适配子与HCV-E2靶蛋白结合的解离常数(Kd)。实时定量RT-PCR(Real-time QRT-PCR)、蛋白质印迹(Western Blot)和免疫共聚焦显微镜方法检测单适配子抑制HCVcc对肝癌细胞Huh7.5.1的感染。FCM法测定适配子和HCV受体CD81蛋白竞争性结合HCV。酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测单适配子与纯化的HCV-E2蛋白、表达在细胞表面的HCV-E2蛋白和HCVcc的结合率；ELISA方法测定单适配子及其突变体与HCV不同基因型的结合差异；与HCV-E2肽片段P1-P15的结合能力。ELISA方法观测单适配子核心部分N30或其突变与HCVcc颗粒及HCV病人血清的结合能力。结果：1.首次成功运用CS-SELEX技术以稳定表达HCV-E2蛋白的E2-CT26细胞系为阳性筛选细胞,通过14轮筛选得到HCV包膜糖蛋白E2的ssDNA适配子库,其中第13轮E2适配子库与E2-CT26细胞的结合力最高(87%)。2.将第13库E2适配子克隆到pUC19得到30个单克隆的测序结果,命名为ZE1至ZE30,其中单适配子ZE18表现出与E2蛋白最强的的结合能力,解离常数(Kd)为1.054±0.4 nM～63.1±9.3nM；即亲合力顺序：ZE18>13th P>ZE25>ZE16>12th P>ZE21>10th P>4th P>14th P。单适配子ZE18及其突变体mZE18与靶分子E2能够结合,并且结合能力呈现剂量依赖性；但是其突变体结合力弱于野生型并且可以穿透细胞膜出现在细胞浆内。适配子的MTT方法毒性测定结果：IC50为10.47mM。3.单适配子ZE18和第13库适配子都能够与HCVcc颗粒结合并且结合能力呈剂量依赖性,其中ZE18结合能力最强。4.此外,适配子还具有抑制E2蛋白与靶细胞的结合,其中ZE18明显抑制E2蛋白与人肝癌细胞Huh7.5.1的结合；适配子竞争性抑制HCV的一个重要受体CD81与HCV-E2糖蛋白的结合。适配子库和单适配子能够抑制HCVcc感染靶细胞Huh7.5.1,其中单适配子ZE18阻竭能力最明显。5.进一步确定单适配子ZE18与E2蛋白氨基酸序列结合的关键位点,我们发现单适配子ZE18主要结合HCV-E2肽中的P7片段(Y4g9PPRPCGIVPAKSVCGPVYC508)部位,将P7进一步截短成三个片段后也都有结合力但能力下降,其中ZE18结合能力高于突变体mZE18。适配子ZE18也能够与人肝癌细胞E2-HepG2、HCV cc颗粒和HCV病人血清结合。适配子核心部分ZE18-N30结合能力高于其突变体。6.ZE18具有选择性捕获HCV基因型1a,1b和2a的E2蛋白,并且其结合率是其它HCV基因型E2蛋白结合率的2倍以上。结论：1.根据国内外文献所报道,本研究课题成功首次运用CS-SELEX技术筛选得到与丙型肝炎病毒包膜糖蛋白E2具有特异性结合并且高亲合力的HCV包膜糖蛋白E2的ssDNA适配子。2.体外HCV水平的研究说明,单适配子能够结合HCV；并且具有抑制HCV与HCV受体或靶细胞的结合,阻竭HCV感染靶细胞；同时适配子的细胞毒性较低。本研究提示所筛选的适配子,特别是单适配子ZE18,不仅有望作为早期检测HCV感染的新型诊断试剂,而且作为HCV拮抗剂对于丙型肝炎的治疗具有潜在应用价值。