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目的研究携带针对丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)的小干扰RNA(siRNA)的Vitamin E(VE)脂质体纳米颗粒靶向抑制HCV复制的作用。方法1.分别构建持续复制表达HCV亚基因组的细胞株和瞬时表达HCV core蛋白的细胞株,并分别通过蛋白印迹和免疫荧光技术对细胞模型进行鉴定。2.设计干扰HCV复制子和干扰HCV core的siRNA,分别转染相应细胞,通过荧光定量PCR和蛋白印迹技术测定相关蛋白的表达情况,以验证其干扰效果。3.通过薄膜水化法制备纳米颗粒VE-DC,将VE-DC与cy3标记的小干扰片段(siRNA-cy3)以不同的摩尔比例进行孵育,处理Huh7.5.1细胞后通过流式细胞技术检测不同组转染效率来筛选最佳包封率。应用激光粒度分析、透射电子显微镜、凝胶电泳、CCK8试验检测纳米颗粒VE-DC/siRNA粒径、Zeta电位、血清稳定性及毒性。4.VE-DC/siRNA-cy3处理Huh7.5.1-HCV细胞,通过荧光显微镜检测VE-DC/siRNAs的入胞情况。用特异性VE-DC/siRNA分别处理Huh7.5.1-HCV、Huh7.5.1-Core,通过荧光定量PCR、蛋白印迹和免疫荧光等方法测定基因与蛋白水平的表达水平,验证其有效性。5.用DC/siRNA(siRNA-5’UTR)或者VE-DC/siRNA(siRNA-5’UTR)处理由质粒p RL-PK与p GL3-5’UTR-luc共转染的Huh7.5.1细胞,采用多功能酶分析仪检测相对荧光素酶活性进一步验证对HCV复制的抑制作用。6.采用高压水动力法尾静脉注射质粒p-Core-3FLAG至BALB/c小鼠中,构建肝脏特异性表达HCV core蛋白的动物模型,通过蛋白印迹和免疫荧光验证肝脏HCV core的表达。在建好的动物模型中通过尾静脉注射纳米颗粒VE-DC/siRNA(siRNA-core),验证其在体内的干扰能力及靶向性。7.采用高压水动力法向BAL B/c小鼠注射p GL3-5’UTR-luc质粒,建立肝脏HCV 5’UTR调控的荧光素酶表达的动物模型;尾静脉注射纳米颗粒VE-DC/siRNA(siRNA-5’UTR)后,用活体成像技术检测荧光素酶的活性,来验证体内的抑制效果。8.检测重要脏器的组织学变化,血液系统的变化,生化反应变化等指标,来检测分析VE-DC/siRNA可能对机体的副作用。结果1.成功构建了Vitamin E、胆固醇和DOTAP合成的VE脂质体纳米颗粒,该VE脂质体纳米颗粒VE-DC/siRNA的粒度分布为125.5±9.0 nm,zeta电位39.1±4.8 m V,形态呈球形,分散均一,细胞毒性相对较小,较好的血清稳定性,且VE-DC/siRNA-cy3在1:1比例混合时转染效率最高。2.成功建立Huh7.5.1-HCV和Huh7.5.1-Core细胞模型,VE-DC/siRNA处理Huh7.5.1-HCV和Huh7.5.1-Core细胞后可见胞内大量颗粒状荧光的聚集且目的蛋白(NS3、NS5A、HCV core)表达量显著降低。3.成功构建肝脏特异性表达HCV core蛋白的动物模型,VE-DC/siRNA-cy3对肝脏有较好的器官靶向性,并有效抑制HCV core的表达。4.在小鼠体内,纳米颗粒VE-DC携带siRNAs抑制HCV 5’UTR调控的荧光素酶的表达,荧光素酶活性明显降低。5.该纳米颗粒对细胞和小鼠无明显毒副作用。结论VE脂质体纳米颗粒携带siRNA可抑制HCV的复制。基于VE脂质体纳米颗粒为平台的RNA干扰技术在HCV基因治疗的临床应用方面提供新的思路,具有潜在的临床应用价值。