白背飞虱Sogatelalfurcifera是水稻上的重要害虫之一,以若虫和成虫刺吸水稻汁液或产卵于叶鞘内为害;同时,还能传播南方水稻黑条矮缩病等多种病毒,造成间接为害,严重影响水稻的生产。白背飞虱属于典型的r-对策害虫,具有极强的环境适应性和生殖能力,易爆发成灾。目前,在白背飞虱的防治中,化学防治依然是主要的控制方法,但杀虫剂的不合理使用导致其对多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性。同时,杀虫剂施用于田间后,除了致死作用外,还会由于时间的推移和个体接触的差异,致死浓度会降低为亚致死浓度,对害虫造成亚致死效应。有研究表明,亚致死浓度的杀虫剂能够刺激害虫的生殖,从而导致害虫的再猖獗。因此,生殖力增强可能是昆虫对杀虫剂胁迫的一种主动适应性机制,但目前关于其分子机制尚不清楚。研究昆虫适应杀虫剂胁迫的分子机制,有助于解释害虫再猖獗的问题,为田间的用药提供理论指导,同时还有助于开发新的害虫防治方法,对有害生物进行可持续治理。本论文以白背飞虱为研究对象,聚焦与其生殖相关的基因,对其在白背飞虱生殖中的功能进行研究,并进一步分析其与三唑磷胁迫之间的关系,探究白背飞虱应对三唑磷胁迫的生殖适应机制。主要研究结果如下:1杀虫剂胁迫下白背飞虱的转录组分析以吡虫啉、三唑磷和溴氰菊酯亚致死浓度LC10胁迫白背飞虱5龄第1 d若虫48 h后,采用高通量测序技术进行分析,去除低质量序列后,共得到了 6.66 Gb数据。组装并去冗余后得到40,597个unigene,其总长度,平均长度,N50以及 GC 含量分别为 38,797,336 bp,955 bp,1,741 bp 和 37.84%。将 unigene比对到七大功能数据库进行注释,最终共有21,556个（53.10%）unigene在一个或多个数据库中被注释到。差异表达分析结果表明:与对照相比,在吡虫啉、三唑磷和溴氰菊酯亚致死浓度LC10胁迫处理中分别有1,123、841和316个unigenes被显著上调。在吡虫啉亚致死浓度LC10胁迫后有7个细胞色素P450（2个CYP2 clade,3 个 CYP3 clade 和 2 个 CYP4 clade）,1 个 GST,1 个 ABC 转运蛋白（ABCF）和7个Hsps（1个Hsp90和6个Hsp70）基因被显著上调;溴氰菊酯亚致死浓度LC10胁迫后有1个细胞色素P450（CYP3 clade）,2个ABC转运蛋白（1个ABCF和1个ABCD）和1个Hsp（Hsp90）基因被显著上调;三唑磷亚致死浓度LC10胁迫后有一个细胞色素P450（CYP3 clade）和1个ABC转运蛋白（ABCF）基因被显著上调。另外,溴氰菊酯和三唑磷亚致死浓度LC10胁迫后,能够诱导雷帕霉素靶蛋白（TOR）、核糖体蛋白S6激酶（S6K）、卵黄原蛋白（Vg）和卵黄原蛋白受体（VgR）的转录水平;而吡虫啉亚致死浓度LC10胁迫后,能够抑制法尼酸甲基转移酶（FAMeT）、S6K和3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶（HMGR）的转录水平。在这些上调表达的基因中,有80个unigenes在三种杀虫剂的胁迫下均显著上调,其中一些基因与昆虫的表皮形成和降解有关。为了验证这些共同差异表达的基因是否在其它杀虫剂胁迫下也能够被诱导表达,以吡虫啉,三唑磷,溴氰菊酯,噻虫嗪,吡蚜酮,毒死蜱和阿维菌素采用同样的方式处理5龄第1d若虫后对候选基因进行表达分析,其结果表明,这些差异表达的基因,并不能够被所有的杀虫剂胁迫后诱导表达,只能在部分杀虫剂的胁迫下被诱导表达。2白背飞虱SfVg和SfVgR的克隆及其功能研究卵黄原蛋白（Vg）是卵黄蛋白的前体,主要是在昆虫的脂肪体内合成,并通过卵黄原蛋白受体（VgR）的内吞作用进入卵巢,为卵巢的发育和卵子的成熟提供营养。基于白背飞虱转录组和基因组数据,鉴定出1个Vg（SfVg）、1个Vg-like（SfVg-like）和 1个 VgR（SfVgR）。通过 RT-PCR 和 RACE 技术,对其序列的准确性进行验证,最终获得了 3个基因完整的OFR,长度分别为6108、6060和5796 bp,分别编码2035、2019和1931个氨基酸。保守结构域分析发现,SfVg具有三个保守结构域,而SfVg-like丢失了传统昆虫Vgs中存在的DUF1943结构域。系统发育分析表明,SfVg-like没有与昆虫中常规的Vgs聚集在一起,而是单独与其它昆虫中同样丢失了 DUF1943结构域的Vg-like聚集在一起。时空表达分析表明,SfVg和SfVgR主要在雌虫中表达,且呈现出先升高后降低的趋势;而SfVg-like除了在雌虫中高表达外,还在卵和2龄若虫中具有较高的转录水平。组织特异性分析显示表明,SfVg和SfVg-like在脂肪体中表达量最高,而SfVgR在卵巢中表达量最高。利用RNAi技术靶向沉默SfVg和SfVgR后,导致雌虫卵巢停止发育,没有香蕉形成熟卵细胞出现,其雌虫的产卵量和孵化率均显著低于对照组;而沉默SfVg-like后并没有观察到类似的现象。酶联免疫分析结果表明,沉默SfVg后,显著降低雌虫体内Vg合成,而沉默SfVg-like和SfVgR后对雌虫体内Vg的含量并无显著影响;同时,沉默SfVgR后,将导致雌虫卵巢中Vg含量显著低于对照组,表明沉默SfVgR后阻碍了 Vg进入卵巢。3白背飞虱JH信号通路基因的克隆及功能分析对白背飞虱转录组和基因组的注释信息进行查找,并以RT-PCR和RACE技术对其序列进行验证,最终克隆得到了白背飞虱的10个JH信号通路基因。根据其序列的相似性和保守结构域分析,分别命名为SfMevPPD、SfHMGR、SfIPPI、SfFPPS1、SfFPPS2、SfFPPS-like、SfJHAMT、SfFAMeT、SfMet和SfKr-h1。系统发育分析表明,它们均与灰飞虱、褐飞虱的亲缘关系最近,同时与其它半翅目昆虫的相应基因单独聚集为一个大的半翅目分支。发育阶段和组织部位分析结果表明,大多数基因均是在5龄若虫期和成虫期具有较高的表达水平;同时,SfHMGR、SfFPPS2、SfFPPS-like、SfJHAMT、SfFAMeT和 SfKr-h1在卵期也具有较高的表达水平。SfIPPI、SfFPPS1、SfJHAMT和SfKr-h1在头部和表皮中具有较高的表达;SfFPPS2和SfMet在卵巢中具有较高的表达;SfMevPPD、SfHMGR、SfFPPS-like和SfFAMeT均是在脂肪体中高表达。进一步采用RNAi技术对其在白背飞虱生殖过程中的功能进行分析。注射dsRNA后,目的基因的沉默效率达到 66.35%-88.56%。注射dsHMGR,dsIPPI,dsFPPS1,dsFPPS2,dsFPPS-like,dsJHAMT,dsFAMeT,dsMet和 dsKr-h1后,雌虫的产卵量均显著低于dsGFP对照组,并且显著抑制了雌虫卵巢发育和SfVg的转录水平,表明这些基因在白背飞虱的生殖过程中发挥着重要的作用。同时,也发现,在dsJHAMT和dsFAMeT的处理组中,它们对白背飞虱的生殖抑制作用并没有其它基因那么显著。进一步的组合干扰实验显示,SfJHAMT和SfFAMeT的共同沉默对雌虫生殖的影响显著高于两个基因单独沉默,对SfVg的转录水平测定结果也证明了这一点;但是,这种影响可以通过体外注射保幼激素类似物得到一定的补偿,证明SfJHAMT和SfFAMeT的沉默,是通过影响JH生物合成来影响白背飞虱的生殖。另外,靶标基因沉默后,我们还测定了对其它9个JH信号通路相关基因的转录水平的影响,结果表明:这些基因之间相互存在着一定的调节作用,尤其是JH生物合成相关的上游基因对下游基因具有显著的调节作用。4白背飞虱TOR信号通路相关基因的克隆及其功能研究使用关键词对白背飞虱转录组和基因组的注释信息进行查找,并使用Genious R9软件,以褐飞虱相应基因为模板对白背飞虱的转录组数据进行同源性搜索拼接,获得了 4个白背飞虱TOR信号通路相关基因。根据其序列的相似性和保守结构域分析,分别命名为SfRheb、SfTOR、SfS6K和Sf4EBP。并以RT-PCR和RACE技术对其序列进行验证,最终获得的4个基因完整的OFR长度分别为549、7488、1389和357 bp,分别编码182、2495、462和118个氨基酸。系统发育分析表明,这些基因均与灰飞虱、褐飞虱相应基因的亲缘关系最近,同时与其它半翅目昆虫的相应基因单独聚集为一个大的半翅目分支。时空表达分析结果表明,所有基因均在初羽化雌虫中具有较高的表达水平,并且SfRheb和Sf4EBP在5龄第4d的表达水平最高;另外,SfRheb、SfTOR和SfS6K在头部和表皮中具有较高的表达水平,而Sf4EBP则是在表皮和卵巢中具有较高的表达水平。进一步采用RNAi技术对其在白背飞虱生殖过程中的功能进行研究。注射dsRNA后,目的基因的沉默效率达到73.91%-86.09%,沉默效率相对较高。生物测定分析结果表明:在注射dsRheb、dsTOR和dsS6K的处理组中,雌虫的产卵量显著低于dsGFP对照组,分别降低了 71.38%、51.78%、59.87%;并且显著抑制了雌虫卵巢发育和SfVg的转录水平,表明这些基因在白背飞虱的生殖过程中具有重要作用。体外注射JH类似物的实验发现,注射JH类似物后,能够恢复由于SfRheb和SfTOR沉默对白背飞虱产卵和卵巢发育以及SfVg表达的影响;同时,沉默SfRheb、SfTOR和SfS6K基因后,也能够显著影响JH生物合成相关基因的转录水平,进一步证明SfRheb和SfTOR基因可以通过影响JH的生物合成来调控白背飞虱的生殖。5三唑磷胁迫刺激白背飞虱生殖的分子机制本项目组前期的研究中发现,亚致死浓度的三唑磷能够显著诱导白背飞虱繁殖力,而亚致死浓度的噻虫嗪能够显著抑制白背飞虱的繁殖力。因此,本章节在前期的研究基础之上,以亚致死浓度的三唑磷和噻虫嗪（LC10和LC25）胁迫白背飞虱3龄若虫48h后,测定羽化第3d雌虫体内与生殖相关基因的表达水平。结果表明:三唑磷LC25处理能够显著诱导白背飞虱SfVg/SfVgR的转录水平,同时,增加体内SfVg蛋白的含量。三唑磷LC25处理,还能够显著诱导JH信号通路和TOR信号通路相关基因的转录水平。而噻虫嗪胁迫后得到了与三唑磷LC25处理相反的结果,虽然部分基因的转录水平变化不一致。另外,LC10处理组对这些基因的转录水平并无显著性影响,但与LC25处理组相比却存在着显著差异,表明不同浓度的三唑磷胁迫下,对白背飞虱的生殖调控机制不同,存在着显著的剂量效应。结合前期的研究结果可以推断,杀虫剂可以通过影响TOR信号通路相关基因的转录来调控JH信号通路,进而调控SfVg的转录水平,最终调节白背飞虱的生殖（刺激生殖或抑制生殖）。综上所述,本论文以杀虫剂胁迫刺激害虫生殖为切入点,借助转录组测序技术筛选与生殖相关基因,并对Vg/VgR、JH信号通路和TOR信号通路相关基因在白背飞虱生殖过程中的功能进行深入研究;以杀虫剂胁迫白背飞虱后,采用RT-qPCR技术测定生殖相关基因的表达情况,探讨杀虫剂胁迫与这些基因表达的关系,初步明确三唑磷刺激白背飞虱生殖的分子机制。本论文研究结果不仅加深了对昆虫响应三唑磷胁迫的生殖适应分子机制的研究,同时筛选出一些调节白背飞虱生殖的关键基因,可作为未来白背飞虱防治的作用靶标。