乙型肝炎病毒感染（HBV）可引起人类急性及慢性乙型肝炎，在世界范围内HBV广泛流行。据世界卫生组织报道，全球超过20亿人口曾感染HBV，超过3.5亿人是慢性HBV携带者。我国是HBV感染高流行地区，据估计我国约有9300万HBV携带者，其中包括约2000万慢性乙型肝炎患者。持续HBV感染增加终末期肝病如肝功能衰竭、失代偿期肝硬化、肝细胞癌发生风险。　　早期诊断HBV感染，及时制定抗病毒治疗方案，抑制HBV复制和肝脏炎症，能够延缓或阻止肝功能衰竭、失代偿期肝硬化、肝癌等并发症发生。临床上主要通过检测血清中HBV标志物，判断有无HBV感染，以及感染不同阶段。常见血清学标志物包括：HBsAg，抗HBs，HBeAg，抗HBe和抗HBc IgM和IgG。其中HBsAg是HBV感染的标志。抗HBs是一种中和抗体，能够中和外周血中循环的HBsAg和具有感染性HBV颗粒，它的出现提示病毒清除，并代表对HBV感染的免疫力。在HBV感染过程中，HBsAg、抗HBs序贯出现，理论上HBsAg、抗HBs不会在HBV感染者的血清中同时阳性。然而，较多研究报道临床实际工作中存在HBsAg/抗HBs同时阳性的特殊现象，并且这一现象并非个例。近年来研究数据显示慢性HBV感染中出现HBsAg/抗HBs同时阳性发生率约为2.8-8.9%，而我国研究结果为2.43-5%。　　目前有关HBsAg/抗HBs同时阳性（简称双阳）产生机制的理论众说纷纭，尚没有统一结论。目前较多研究支持HBsAg突变，尤其是a决定簇突变可导致HBsAg抗原性改变，引起特异性抗HBs不能识别并结合HBsAg，即产生HBV免疫逃逸体，从而导致血清中HBsAg与抗HBs双阳现象。除HBsAg外，HBV包膜蛋白构成还包括preS基因所编码preS1、preS2蛋白，有研究表明慢性HBV感染者HBsAg/抗HBs双阳的产生与preS基因突变有关。与上述理论不同，也有研究表明HBsAg/抗HBs双阳产生与HBsAg突变无关，而是由于血清中共存的抗HBs为异源亚型特异性抗体，对于共存的HBsAg不具有特异性，因此不能起到中和作用。在这种情况下HBsAg序列不是突变的HBsAg，而是与抗HBs异源特异性相关的野生型序列。　　综上所述，慢性HBV感染者出现HBsAg/抗HBs双阳的机制尚未完全明确。虽然较多研究支持HBsAg突变引起HBV免疫逃逸与HBsAg/抗HBs双阳产生有关，但对于HBsAg具体发生突变位点，不同研究结果之间存在争议。对于同样编码包膜蛋白的preS基因突变能否产生HBsAg/抗HBs同时阳性，仍需要进一步研究。　　研究目的：　　分析HBsAg/抗HBs双阳患者HBV preS/S基因突变的特征，探索HBsAg/抗HBs双阳性产生的潜在病毒机制，为评估这些患者临床预后以及制定治疗方案提供理论依据。　　研究方法：　　1.研究对象：以HBsAg和抗HBs双阳标本作为实验组（双阳组），HBsAg阳性、抗HBs阴性标本作为对照组（单阳组），收集两组患者基本信息以及临床资料，包括乙肝两对半、HBV DNA、ALT、AST、ALB等；　　2.核酸提取、扩增及测序：采用核酸提取试剂盒提取HBV DNA，然后通过两轮巢式PCR扩增出PreS/S基因全长序列，凝胶电泳方法回收、纯化PCR产物。纯化后PCR产物单克隆测序，单克隆制备采用T-A克隆法，包括连接、转化、挑单菌落培养、菌液PCR鉴定、送菌液产物测序。　　3.序列比对、分析：测序结果用CExpress、BioEdit等生物软件进行拼接，并与NCBI的GenBank中HBV野生株对比，确定基因型。将患者测序序列和NCBI获取的相应基因型核酸序列分别翻译成相应的氨基酸序列，以NCBI的相应基因型氨基酸序列为标准进行比对，得到各个患者的HBV氨基酸序列信息。根据HBV氨基酸变化情况，分析HBV PreS/S基因突变特征。　　4.统计分析：采用软件SPSS16.0进行统计学分析。计量资料符合正态分布且方差齐，两组之间比较采用t检验，多组之间比较采用方差分析；不符合正态分布和方差齐采用非参数分析，如秩和检验。定性资料采用卡方检验。P值＜0.05表示有统计学意义。　　研究结果：　　1.共收集HBsAg/抗HBs双阳患者81例，成功扩增并测序共51例，其中基因B型32例，基因C型19例；单阳患者共50例，成功扩增并测序44例，其中基因B型34例，基因C型10例。　　2.基因B型患者，双阳组N末端区域氨基酸突变率显著高于单阳组（24/32比16/34，P=0.025），两组在MHR、a决定簇、C末端区域氨基酸突变率无显著差异（P>0.05）。两组患者MHR区域及a决定簇内各氨基酸位点突变率均无显著差异（P＞0.05）　　3.基因C型患者，双阳组MHR以及a决定簇区域氨基酸突变率显著高于单阳组（13/19比2/10，P=0.021），在N末端区域双阳组氨基酸突变率也显著高于单阳组（19/19比6/10，P=0.009），而在C末端区域两组氨基酸突变率没有显著差异（18/19比7/10，P=0.105）。双阳组a决定簇内aa126突变率显著高于单阳组（12/19对比2/10，P=0.033）。　　4.双阳组患者存在preS基因缺失突变，缺失片段均以3的倍数碱基数缺失，在氨基酸水平表现为单个氨基酸缺失或多个氨基酸片段缺失。单阳组患者未发现preS基因缺失突变。双阳组preS基因缺失突变率显著高于单阳组（12/51比0/44，P＜0.001），对不同基因型患者进一步分析，基因B型双阳组患者preS基因缺失突变显著高于单阳组（5/32比0/34，P=0.023）；基因C型双阳组患者PreS缺失突变率高于单阳组（7/19比0/10），但两组间差异无统计学意义（P=0.063）。　　研究结论：　　1.HBsAg/抗HBs双阳慢性HBV感染者HBsAg突变和preS基因缺失突变显著增加。基因B型患者HBsAg N末端区域氨基酸变异以及preS基因缺失突变显著增加，提示基因B型HBsAg/抗HBs同时阳性可能与HBsAg突变以及preS基因缺失突变有关。　　2.基因C型双阳患者HBsAg MHR、a决定簇，以及N末端区域氨基酸变异显著增加，尤其是在a决定簇内aa126，提示基因C型HBsAg/抗HBs同时阳性可能与HBsAg突变，尤其是aa126位点突变有关。