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H9N2亚型禽流感自1992年至今一直以地方性流行形式存在于我国各大禽群中,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失。在2010~2013年,H9N2禽流感在我国出现第二次暴发。研究表明,引起此轮疫情的是新出现的G57基因型病毒,而现有疫苗无法对其提供完全保护。本研究分析发现,分离自2012年吉林省免疫鸡群的5株H9N2病毒的HA基因在进化树上不同于Y280-like亚系内的其他分支病毒,而处于G57-like分支。进一步研究显示,该分支病毒与其他分支病毒之间存在明显的抗原差异,这促使我们研制一种新的H9N2候选疫苗以启动有效的免疫应答来抵御当前优势基因型—G57基因型病毒的流行。为抵御当前在我国鸡群中广泛流行的G57基因型H9N2亚型流感病毒的感染,本研究以L.plantarum NC8菌株作为递呈载体,拟特异性地将病毒的HA蛋白靶向递呈给黏膜DCs,以期制备一种靶向树突状细胞的新型黏膜免疫疫苗。通过体内外试验分析该靶向疫苗对黏膜DCs的成熟、迁移、分化的影响,及其诱导T细胞增殖与极化的潜能,以此初步揭示树突状细胞靶向疫苗在黏膜免疫和获得性免疫应答中的作用机制。黏膜免疫不同于获得性免疫应答的标志是局部SIgA的分泌。因此,本研究检测了重组乳酸菌免疫后肺、肠和粪便中SIgA抗体的水平。夹心ELISA结果显示,在整个免疫期,甚至攻毒后,Lp-HA-DCpep免疫组的支气管肺泡灌洗液、肠道灌洗液和粪便中的SIgA抗体水平普遍高于Lp-HA和Lp组,说明Lp-HA-DCpep能够更有效地激活局部黏膜免疫应答。血清中IgG检测结果显示,虽然免疫后Lp-HA-DCpep组IgG水平略低于Lp-HA组,但是在攻毒后,Lp-HA-DCpep组IgG抗体水平显著升高。另外,Lp-HA-DCpep免疫组小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12p70等细胞因子水平均普遍高于其他各组。这些结果表明,Lp-HA-DCpep诱导局部黏膜和获得性免疫应答的能力更强。为了评价重组乳酸菌的免疫保护效果,通过免疫组织化学检测了免疫攻毒后小鼠肺脏中的病毒载毒情况。结果显示,Lp-HA-Dcpep免疫组的小鼠肺脏中几乎没有检测到病毒抗原,但有轻微的病理变化,说明Lp-HA-Dcpep能够更有效地介导免疫应答,保护小鼠免于G57基因型病毒的攻击。总之,Lp-HA-DCpep具有更好的诱导局部黏膜免疫和获得性免疫应答的潜能。DCs表面标志分子表达量以及DCs分泌细胞因子水平升高是DCs成熟的标志。流式分析结果显示,各乳酸菌均可以上调DCs表面MHC II、CD40、CD80以及CD86的表达。其中,Lp-HA-DCpep组MHC II和CD86的△MFI显著高于其他实验组,表面它能够更有效地诱导DCs成熟。DCs分泌细胞因子结果显示,各乳酸菌均能够诱导DCs分泌TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12p70。其中,Lp-HA-Dcpep组TNF-α、IL-6和IL-10的分泌水平显著高于Lp-HA组和Lp组,说明Lp-HA-Dcpep在诱导DCs分泌成熟相关细胞因子的能力方面具有一定的优势。肠道中L.plantarum能够持续地调节免疫,而肠道DCs在激活先天性免疫应答中的作用至关重要。MLR试验结果显示,Lp-HA-DCpep能够促使DCs更有效地内吞FITC-Dextran,并有效激活T细胞。尽管非重组乳酸菌和重组乳酸菌均可以上调表达DCs表面标志分子,并促使其分泌细胞因子,但是靶向DCs重组乳酸菌Lp-HA-Dcpep诱导DCs成熟的能力优于其他乳酸菌组,推测DCpep靶向修饰的HA抗原更容易被靶向递呈给DCs而利于其表型和功能成熟。TLR4是细菌抗原的主要PRR,能够活化DCs的NF-κB通路。为了探索乳酸菌是否可以活化DCs,将DCs经TLR4抑制剂或NF-κB抑制剂处理后,再与乳酸菌相互作用。结果显示,DCs表面标志分子的表达均受到TKA-242(TLR4抑制剂)和PDTC(NF-κB抑制剂)的影响,表现为DCs表面标志分子的表达水平出现不同程度的降低,说明乳酸菌诱导的DCs成熟依赖TLR4/NF-κB信号通路的调控。DCs表面趋化因子受体CCR7的上调是其迁移到次级淋巴器官并启动获得性免疫应答的必要条件。DCs迁移依赖于CCR7的两个配体分子CCL19和CCL21。本研究结果显示,Lp-HA-DCpep能够显著上调DCs表面CCR7的表达。DCs体外迁移试验结果显示,当在Transwell系统中加入CCL19或/和CCL21,能够诱导Lp-HA-DCpep处理的DCs发生迁移,此种迁移可以被CCL19或/和CCL21抗体部分阻断。由此表明,Lp-HA-DCpep能够经由CCR7-CCL19/CCL21轴诱导DCs迁移。体内迁移试验结果显示,在MLN和脾脏中,随着免疫次数的增多,Lp-HA-DCpep免疫组迁移性DCs(CD3-CD11c+MHC II+DCs)数量显著累积,直至免疫后第42天,表明Lp-HA-DCpep能够招募更多的迁移性DCs向次级淋巴器官迁移。DCs的激活伴随着DCs亚群的分化。其中,迁移至MLN中的DCs表型主要是CD11c+MHC II+CD103+CD11b+(简称CD103+CD11b+)和CD11c+MHC II+CD103+CD11b-(简称CD103+CD11b-),而迁移至脾脏中的DCs分化表型主要是CD11c+MHC II+CD8α+(简称CD8α+)和CD11c+MHC II+CD8α-(简称CD8α-)。本研究结果显示,在MLN中,Lp-HA-DCpep免疫组的CD103+CD11b+DCs和CD103+CD11bDCs细胞数量显著高于其他各组;在脾脏中,虽然Lp-HA-DCpep免疫组仅在免疫后第21天和第42天CD8α+DCs的细胞数量显著高于其他各组,但CD8α-DCs数量在各检测时间点均高于其他各组。因此,Lp-HA-DCpep能够更有效地促进DCs的亚群分化。DCs是唯一能够活化T细胞的专职抗原递呈细胞。为了评价免疫后T细胞的活化情况,本研究通过流式细胞术检测了脾脏中T细胞的亚群数量。研究结果显示,免疫后Lp-HA-DCpep组脾脏中Th(CD3+CD4+)和Tc(CD3+CD8+)细胞的数量显著增加,表明Lp-HA-DCpep不仅能够靶向DCs,而且能够促进迁移后的DCs激活初始T细胞。本研究进一步检测了脾脏中Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Th2(CD3+CD4+IL-4+/IL-5+/IL-13+)、Th17(CD3+CD4+IL-17a+)、Treg(CD3+CD4+CD25+Foxp3+)、Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)和Tc2(CD3+CD8+IL-4+)的百分含量,以检测Th和Tc细胞的极化能力。结果显示,在免疫后第21天和42天,Lp-HA-DCpep组的Th1、Th2和Treg细胞普遍显著高于其他组。此外,Lp-HA-DCpep组的Tc1细胞在免疫后21和42天显著高于Lp-HA组;而对于Tc2细胞,两组无显著差异。这些结果表明Lp-HA-DCpep不仅能够有效激活Th和Tc细胞,而且能够诱导Th细胞向Th1、Th2和Treg细胞极化,T细胞的极化能力随着免疫次数的增加而增强。上述研究结果表明,所构建的靶向DCs重组乳酸菌—Lp-HA-DCpep能够通过TLR4介导的NF-κB信号通路促使DCs表型和功能成熟,经由CCR7-CCL19/CCL21轴指引DCs由黏膜向次级淋巴器官迁移,迁移性DCs刺激了T细胞的增殖,并促使Th细胞向Th1、Th2和Treg细胞亚群极化,从而诱导产生了更高效的黏膜免疫和获得性免疫应答,最终有效地阻止了G57基因型H9N2流感病毒的感染。