基于量子点发光技术改进的流式细胞术在分子检测领域的应用研究

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分子检测是一类常见的检测方法,检测样本包括DNA、RNA、蛋白质等小分子物质,根据检测样本类型将这一类检测统称为分子检测,在临床上又将这一部分检测内容称为分子诊断。针对DNA、RNA类核酸样本的检测,常见的技术包括:PCR、DNA测序技术、荧光原位杂交技术(FISH),DNA杂交印记技术,基因芯片技术等,而在分子检测领域中则除了这部分内容还包含流式、免疫组化、ELISA等其他检测蛋白、抗体等小分子的方法。这其中流式细胞术因具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点,是目前先进的细胞定量分析技术之一,也被广泛应用于分子检测领域。但是流式细胞术具有一定的应用局限性即其能针对细胞或大分子类生物颗粒进行检测,像小分子物质如蛋白、核酸等均无法进行直接的检测,这就引出了CBA法。CBA法是流式巨头BD公司发明的一种微量样本多标记检测技术,以成品试剂盒的方式进行售卖,实现小分子样本的检测,但是成本很高,没检测一种样本就需要购买相应的试剂盒。如何构建一种价格低廉,通用性高的流式检测模型来实现小分子样本的检测?这就是本文的主要研究内容。本研究介绍了一种可以应用于小分子样本流式检测的通用模型,其除了可应用于流式细胞术外还可以应用于免疫组化、ELISA等方法。该检测模型的设计原理基于酶联免疫,灵感来自于流式细胞术中的CBA法。我们都知道流式细胞术中的CBA法,即微量样本多指标流式蛋白定量技术。它是以一系列荧光标记的均一微球连接特定的捕获抗体,当溶液体系中含有待测抗原时微球会捕获抗原,再加入对应各种不同抗原的荧光二抗,形成一个双荧光标记的夹心纳米复合物。根据纳米复合物荧光种类以及强度的不同可同时测定液体样本中多种可溶性成分。既可以定性又可以定量。检测的样本类型可以是血清、血浆、细胞培养液、组织裂解液等各种液相样本中的可溶性小分子,如细胞因子、蛋白、酶、病毒等。CBA法优点很多但是价格昂贵,所以本研究设计的新型检测模型在摒弃了CBA法昂贵的缺点外,继承了它操作简单、准确性高等优势,此外这种检测方法是一种通用的方法,不需要购买繁杂种类的试剂盒,只需购买相应的2种抗体即可完成对待测分子的检测。而且检测样本可以是可溶性细胞因子、炎症因子、趋化因子、酶等蛋白类成分,也可以是病毒、小分子核酸等非蛋白类成分。只需要相应的抗体就可以借助我们的通用模型完成检测。我们首先以G5代PAMAM修饰羊抗兔IgG,形成一个纳米颗粒用于捕获跟担载相应的兔抗,另一边用水溶性硒化镉量子点修饰羊抗鼠IgG,用来捕获鼠抗并形成指示探针。在这个体系中只要加入相应的鼠抗跟兔抗,就会形成三明治夹心型的纳米复合物,这样就可以使得待测指标在流式中被检测出来。与传统的CBA法相比,省去了复杂的试剂盒购买过程,只需要单独购买相应的鼠抗兔抗两种抗体即可完成待测指标的流式检测。此外PAMAM修饰的羊抗兔IgG与QDs修饰的羊抗鼠IgG这两部分也可以分开使用。如仅使用QDs修饰的羊抗鼠IgG,用于免疫组化,免疫细胞化学技术等方法。综上所述,本文详细的介绍了一种可应用于流式检测的通用实验模型,其包含两部分,分别是G5代PAMAM修饰的羊抗兔IgG部分和硒化镉量子点修饰的羊抗鼠IgG部分,当加入相应的兔抗跟鼠抗就会形成三明治夹心型的纳米复合体,使得待测指标被流式检出。该模型成分简单、操作方便、结果准确,相较于传统CBA法只能检测少量指标且成本较高的特点,我们的模型通用性更强且两组分可单独使用,除应用于流式还可应用于免疫组化、免疫细胞化学等方法中,对于分子检测具有很高的应用价值。
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