造血细胞生长因子在血细胞生成调节机制中具有重要意义。主要包括：红细胞生成素(Epo)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(Tpo)和flt3配体(FL)等。人FL(flt3 ligand)是近年发现的重要造血生长因子，主要作用于早期原始的干／祖细胞，促进其增殖和分化。FL与其它因子联合作用，可明显刺激树突状细胞(dendritic cell，DC)的增殖。FL的作用较为广泛，与人SCF(stem cell factor)有些不同，没有明显的种属特异性，它在造血系统原发性或继发性损伤疾病的治疗、外周血干／祖细胞的动员和移植以及肿瘤免疫治疗中都有潜在应用价值。本论文主要包括四部分内容： 1．人FL的分泌表达； 2．人FL的融合表达； 3．人FL的非融合非分泌表达； 4．rhFL部分理化性质及生物学活性测定。 1．FL的分泌表达： 根据已报道的人FL序列和大肠杆菌偏爱密码子合成寡核苷酸片段，通过PCR方法成功地合成人FL基因。为了获得正确折叠、可溶性的具有生物学活性的重组人FL(rhFL)，在FL基因的5’端增加stⅡ的信号肽，用于将目的蛋白定位于大肠杆菌间周质，因为间周质含有催化二硫键形成的蛋白酶。当重组的目的蛋白分泌至间周质时，信号肽被信号肽酶切掉，形成N末端不含任何多余氨基酸的重组人FL。然而，已构建的多个分泌表达载体经诱导表达，SDS—PAGE表明没有明显可见的目的蛋白表达区带。碱性磷酸酶的启动子能够在培养基中缺乏磷的情况下启动碱性磷酸酶基因的表达。以碱性磷酸酶的启动子，连接stⅡ信号肽、FL基因、T7终止子为表达单位，插入pBR322，通过无磷培养基诱导表达，得到的表达产物经SDS-PAGE和western blot鉴定显示有rhFL表达，但表达水平比较低。 2．FL的融合表达： 融合表达能获得较高的表达产量，是基因工程表达重组蛋白的有效策略之一。硫氧还原蛋白(Trx)是大肠杆菌的自体蛋白，将其基因插入表达载体pET30a获得pET30a-Trx。将FL基因连接于Trx基因的3’端，构建成融合表达质粒pET30a-Trx-FL，在Trx与FL之间增加FXa酶切点。将该融合表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导，融合蛋白表达量高达菌体总蛋白的60％，并以包涵体形式存在。经Q-Sepharose-Fast Flow。Superdex75柱层析纯化，Trx-FL纯度达90％。经FXa切