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沼气发酵技术虽然在我国广泛推行,但因温度是沼气发酵的制约性因素。我国北方地区以及新疆本地区冬季寒冷漫长,普遍存在沼气发酵冬季产气量低的问题,沼气发酵的潜力不能充分的发挥,低温是影响沼气推广及制约发酵效率的主要因素,研究添加外源菌剂对低温环境下的微生物菌群变化具有非常大的现实意义。本试验利用高通量测序和宏基因组技术对添加粪肠球型产氢菌（Enterococcus sp.,L1菌）牛粪低温沼气发酵微生物群落结构变化规律进行研究。在沼气发酵反应器中添加不同浓度的L1菌剂（0、1%、5%、10%）,放置于15℃恒温培养箱中进行发酵。记录日产气量,并在发酵不同阶段分别取菌泥提取总DNA,利用高通量测序和宏基因组技术对沼气发酵过程中的微生物群落演替进行分析,对筛选获得的三株菌进行实时荧光定量PCR分析,了解其在不同发酵处理阶段的变化规律。为指导牛粪低温沼气发酵条件的进一步优化奠定理论基础。试验一:目的旨在对前期试验中筛选出的一株产氢菌进行生理生化特性及发酵条件进行研究。在前期大量的牛、羊粪低温沼气发酵预试验过程中,从沼气发酵液中成功分离出一株肠球型产氢菌（Enterococcus sp.）L1,利用光学显微镜观察其菌体的形态特征,并对其进行革兰氏染色、16S rDNA鉴定、生理生化特性及培养基优化研究。光学显微镜观察结果为L1菌为革兰氏阳性菌,无芽孢,无荚膜;16S rDNA鉴定结果该菌为Enterococcus sp.;生理生化特性研究结果表明L1菌可以发酵乳糖产生乳酸,可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖,乳糖产酸,利用淀粉产碱:最适条件的优化结果表明最佳碳源为麦芽糖,最佳氮源为混合氮源,最适pH值为7,最适生长温度30℃,最适Na2HPO4添加量为0.2%。最优培养基组合为麦芽糖 1g/L,酵母膏 10 g/L,蛋白胨 5g/L,Na2HPO42 g/L。试验二:目的旨在研究添加不同浓度L1菌处理对牛粪低温（15℃）发酵条件下甲烷产气量的影响。试验结果为添加10%L1菌的产气量最大,平均日产气率达到0.02 m3/（m3·d）。试验三:目的旨在利用高通量测序技术研究添加不同浓度L1菌处理对牛粪低温（15℃）模拟沼气发酵过程中细菌、古菌菌群变化规律进行分析。本章试验对添加不同浓度（0、1%、5%、10%）L1菌剂的试验组进行低温模拟发酵试验,分别在发酵第10 d、30 d、60 d、90 d取50 mL的发酵液,进行菌泥微生物总DNA的提取,使用HiSeq2500 PE250进行高通量测序。结果显示:在门水平上:古菌菌群主要以广古门菌门（Euryarchaeota）,Tenericutes为主;细菌菌群主要以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）及拟杆菌门（Bacteroidetes）为主。广古门菌门（Euryarchaeota）和拟杆菌门（Bacteroidetes）随着不同发酵阶段的丰度变化相对较大,均呈先增强后降低的趋势。在属水平上:在发酵第60d（产气高峰期阶段）在各处理中的古菌优势菌群均主要为甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）,细菌优势菌群主要为Ruminococcaceae UCG-010。试验四:目的旨在利用宏基因组测序技术对产气量较大的10%处理组低温（15℃）模拟沼气发酵过程中细菌群落变化规律进行分析。本试验采用Illumina HiSeq测序平台测序,共获得87063.52 Mbp的原始数据,经过质控得到86754.85 Mbp的有效数据,注释到属和门的比例分别为55.56%,76.67%。结果显示厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为产甲烷过程的优势群落,螺旋菌门（Spirochaetae）、互养菌门（Synergistetes）和绿弯菌门（Chloroflexi）是产甲烷阶段的新增菌群;在产气高峰期的优势菌属是甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）;代谢通路预测主要以碳水化合物代谢和氨基酸代谢为主。试验五:目的旨在利用实时荧光定量PCR技术研究前期分析获得的三株菌（甲烷囊菌（Methanoculleus）、甲烷八叠球菌（Methanosarcina）和L1菌）在低温（15℃）模拟沼气发酵不同发酵阶段变化规律的研究。结果显示在发酵第60 d时,各处理组的甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）Copies 最多,CK、1%处理、5%处理、10%处理 Copies 分别为 30.98 X 107Copies/μ L、63.77×107Copies/μ L、28.6X 107Copies/μ L、24.35X 107Copies/μ L。且在发酵第60 d各处理甲烷八叠球菌（Methanosarcina）Copies增加量也最大。本试验研究主要得出以下结论:（1）最优添加L1菌浓度为10%处理。（2）在低温（15℃）条件下维持超期发酵系统正常的优势菌为甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）。（3）添加浓度为10%L1菌促进低温（15℃）条件下模拟沼气发酵产气量增加的主要原因是添加浓度为10%L1菌可能为沼气发酵产酸阶段中提供H。