前言:　　 胶质瘤是最常见的恶性脑肿瘤,其发病率和死亡率很高。传统的治疗方法包括手术、放疗和化疗,但治疗效果有限,尤其是针对高级别的胶质瘤,。近年来的研究发现,在脑胶质瘤中存在肿瘤干细胞(GSCs)。GSCs具有自我更新、多向分化潜能及终生增殖分化等特性,目前认为GSCs与脑胶质瘤的发生、恶性生长和复发密切相关,另外GSCs的归巢行为与肿瘤转移灶的形成关系密切。在治疗上,由于GSCs比非肿瘤干细胞对治疗具有更强的抵抗性,导致临床上应用的放化疗手段疗效甚微。因此,GSCs已经成为研究脑胶质瘤治疗的新工具,对GSCs的深入研究可能为脑胶质瘤的治疗提供新的有效途径。　　 拓扑异构酶分为Ⅰ型和Ⅱ型,其中拓扑异构酶Ⅰ(TopoisomeraseⅠ,TopoⅠ)在细胞DNA复制、转录和重组等重要的生命过程中,发挥重要作用,另外TopoⅠ还参与染色体的凝缩,影响染色体结构变化。TopoⅠ是单体酶,起作用的过程是先切开双链DNA中的一条,使键的末端沿螺旋轴按拧松超螺旋的方向转动,导致超螺旋松弛,并将切开的DNA单链再连接。TopoⅠ抑制剂可分为两大类:TopoⅠ毒剂和TopoⅠ阻遏剂。两者都抑制TopoⅠ活性,使DNA不能松弛,但又存在区别。TopoⅠ毒剂捕获TopoⅠ-DNA可裂解复合物,形成“路障”,使复制不能进行,从而导致细胞死亡,其代表的药物为喜树碱类化疗药拓扑替康(Topotecan)等。TopoⅠ阻遏剂的作用则不同,它通过抑制酶的催化活性杀死细胞,TopoⅠ阻遏剂的代表药物为紫草素(shikonin)酰基类似物等。研究证实,TopoⅠ抑制剂具有抗肿瘤作用。经检索,TopoⅠ抑制剂对胶质瘤干细胞的作用尚未见报道。　　 Bcl-2和Caspase都是凋亡相关蛋白,一些抗肿瘤药物通过促进细胞凋亡发挥抑制肿瘤生长的作用。研究报道,紫草素和拓扑替康可以通过对Bcl-2和Caspase的调节促进凋亡。本研究的目的旨在首先探讨紫草素和拓扑替康对GSCs的可能作用,进一步研究紫草素和拓扑替康是否通过调节GSCs的Bcl-2和Caspase蛋白表达促进凋亡,以及是否对GSCs的细胞周期产生阻滞作用,从而抑制GSCs增殖。本研究有望为TopoⅠ抑制剂对脑胶质瘤的治疗提供新的理论和实验依据。　　 实验材料和方法:　　 一、实验材料　　 (一)实验细胞株　　 人U251胶质瘤细胞株和人U87胶质母细胞瘤细胞株均购自南京凯基生物科技发展有限公司。　　 (二)主要试剂　　 紫草素(中国药品生物制品检定所);MTT,DMSO,拓扑替康(美国Sigma公司),DMEM/F-12培养基(美国HyClone公司);胎牛血清(天津灏洋生物科技有限公司);AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司);细胞周期检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司);小鼠抗CD133单克隆抗体,兔抗Nesting多克隆抗体(ProductDescription公司);小鼠抗β-tubulin单克隆抗体,兔抗GFAP多克隆抗体(Abeam公司),小鼠抗拓扑异构酶单克隆抗体,兔抗Bcl-2多克隆抗体,小鼠抗β-actin单克隆抗体,增强化学发光法试剂盒(美国SantaCruz公司);山羊抗兔HRP标记的IgG二抗,山羊抗小鼠HRP标记的IgG二抗,山羊抗小鼠FITC标记的IgG二抗,山羊抗兔CY3标记的IgG二抗(北京中山生物技术公司)。　　 (三)主要仪器　　 细胞培养箱(美国Formascientific公司);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);倒置显微镜(日本TMS公司);紫外.可见光分光光度计(日本岛津公司);BDFACSCalibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司);超声粉碎机(德国Dr.Hielscher公司);台式低温超速离心机(德国Sigma公司);聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(美国Bio-Rad公司);转印仪(北京市六一仪器厂);Las3000成像系统(日本FUJIFILM公司);凝胶成像分析软件(江苏捷达科技有限公司);电子分析天平(德国Sartorius公司);-80℃超低温冰箱(日本SANYO公司);恒温震荡水浴(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)。　　 二、实验方法　　 (一)肿瘤细胞培养　　 (二)实验分组　　 1、对照组1:PBS+U251细胞　　 2、对照组2:PBS+U87细胞　　 3、对照组3:PBS+GSC-U251细胞　　 4、对照组4:PBS+GSC-U87细胞　　 5、紫草素组1:紫草素(2μmol/l)+U251细胞　　 6、紫草素组2:紫草素(2μmol/l)+U87细胞　　 7、紫草素组3:紫草素(2μmol/l)+GSC-U251细胞　　 8、紫草素组4:紫草素(2μmol/l)+GSC-U87细胞　　 9、拓扑替康组1:拓扑替康(3μmol/l)+U251细胞　　 10、拓扑替康组2:拓扑替康(3μmol/l)+U87细胞　　 11、拓扑替康组3:拓扑替康(3μmol/l)+GSC-U251细胞　　 12、拓扑替康组4:拓扑替康(3μmol/l)+GSC-U87细胞　　 (三)细胞增殖抑制实验(MTT比色法)　　 (四)细胞凋亡AnnexinV-FITC/PI检测　　 (五)细胞周期　　 (六)WestemBlot方法检测Bcl-2、Caspase3及Caspase9的变化　　 (七)统计学处理　　 所有数值以均数士标准差(-X±sD)表示,采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行分析,组间比较采用单因素方差分析(Dunnett-t检验),P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果:　　 一、胶质瘤干细胞培养与鉴定　　 从U251和U87细胞中分离出细胞球,细胞球同时表达CDl33及Nesting,即证明细胞球为脑胶质瘤干细胞样细胞;细胞球加入血清分化后,细胞同时表达β-tubulin和GFAP,由此证明分离出的细胞球具有多向分化潜能,进一步证实,细胞球细胞可作为胶质瘤干细胞。　　 二、不同浓度的紫草素作用不同时间对U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞增殖抑制的影响　　 不同浓度的紫草素分别作用U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞12h、24h、48h后,紫草素以剂量依赖方式抑制细胞增殖;与0μmol/l相比,2μmol/l、20μmol/l、40μmol/l的紫草素分别显著抑制细胞增殖(P＜0.01)。作用时间为24小时的U251、U87、GSC-U251和GSC-U87半数抑制率分别为1.84±0.34μmol/l,2.02±0.44μmol/l,3.72±0.27μmol/l,3.95±0.19μmol/l。紫草素作用24小时后显著抑制细胞增殖(P＜0.01),但48小时与24小时相比没有明显变化(P＞0.05),因此,选择24h作为给药时间点,进行后续试验。　　 三、不同浓度的拓扑替康作用不同时间对U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞增殖抑制的影响　　 不同浓度的拓扑替康作用U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞12h、24h、48h后,拓扑替康以剂量依赖方式抑制细胞增殖;与0μmol/l组相比,2μmol/l、20μmol/l、40μmol/l的拓扑替康分别显著抑制细胞增殖(P＜0.01),作用时间为24小时的U251、U87、GSC.U251和GSC-U87半数抑制率分别为2.73±0.25μmol/l,2.95±0.23μmol/l,5.46±0.41μmol/l,5.95±0.24μmol/l。拓扑替康作用24小时后显著抑制细胞增殖(P＜0.01),而48小时与24小时相比没有明显变化(P＞0.05),因此,选择24h作为给药时间点,进行后续试验。　　 四、紫草素和拓扑替康对U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞凋亡的影响　　 紫草素和拓扑替康分别作用U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞24h后,对照组1,紫草素组1和拓扑替康组1的凋亡率(含坏死细胞)分别是2.35±1.94%,39.28±3.21%,38.60±3.08%;对照组2,紫草素组2和拓扑替康组2的凋亡率(含坏死细胞)分别是2.26±1.18%,33.64±5.98%,34.26±5.34%;对照组3,紫草素组3和拓扑替康组3的凋亡率(含坏死细胞)分别是4.15±1.56%,20.68±2.16%,17.36±4.42%;对照组4,紫草素组4和拓扑替康组4的凋亡率(含坏死细胞)分别是4.33±2.43%,13.5±3.2%,14.14±3.01%。流式细胞结果显示,紫草素和拓扑替康分别显著诱导U251、U87、GSC-U251、GSC-U87的凋亡(P＜0.01)。　　 五、紫草素和拓扑替康对U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞周期的影响　　 紫草素和拓扑替康作用U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞24h后,U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞在G1期前面出现了一个小的凋亡峰,U251细胞中对照组1,紫草素组1和拓扑替康组1的凋亡率分别是0.55±0.89%,34.72±1.99%,34.8±2.8%:U87细胞中对照组2,紫草素组2和拓扑替康组2的凋亡率分别是0.88±1.08%,22.94±3.62%,24.26±1.55%;GSC-U251细胞中对照组3,紫草素组3和拓扑替康组3的凋亡率分别是0.79±0.98%,13.73±2.05%,19.59±3.44%;GSC-U87细胞中对照组4,紫草素组4和拓扑替康组4的凋亡率分别是1.44±1.35%,13.24±2.69%,13.17±3.54%。同时,U251细胞中对照组1,紫草素组1和拓扑替康组1的G1+S期RNA含量分别是76.38±4.05%,94.30±2.65%,97.77±1.19%;U87细胞中对照组2,紫草素组2和拓扑替康组2的G1+S期RNA含量分别是82.48±5.07%,97.10±1.20%,98.12±1.49%;GSC-U251细胞中对照组3,紫草素组3和拓扑替康组3的G1+S期RNA含量分别是83.27±3.13%,97.63±3.21%,96.14±3.55%;GSC-U87细胞中对照组4,紫草素组4和拓扑替康组4的G1+S期RNA含量分别是83.97±4.27%,92.84±2.81%,93.15±2.56%;U251细胞中对照组1,紫草素组1和拓扑替康组1的G2期RNA含量分别是21.47±3.04%,5.57±1.52%,1.19±1.03%;U87细胞中对照组2,紫草素组2和拓扑替康组2的G2期RNA含量分别是14.72±1.89%,2.20±0.68%,1.38±1.44%;GSC-U251细胞中对照组3,紫草素组3和拓扑替康组3的G2期RNA含量分别是16.87±2.81%,2.33±2.03%,2.79±1.73%;GSC-U87细胞中对照组4,紫草素组4和拓扑替康组4的G2期RNA含量分别是17.69±2.99%,8.67±2.40%,8.15±2.57%。紫草素和拓扑替康显著增加了U251、U87、GSC-U251、GSC-U87的凋亡率,上述细胞G1与S期的RNA含量显著增多,G2期RNA含量显著降低(P＜0.05)。　　 六、紫草素和拓扑替康对U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞Bcl-2蛋白表达水平的影响　　 紫草素和拓扑替康作用U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞24h后,与对照组1,对照组2,对照组3,对照组4相比,紫草素和拓扑替康对四种细胞的Bcl-2蛋白表达都具有显著的抑制作用(P＜0.01).　　 七、紫草素和拓扑替康对U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞Caspase3蛋白表达水平的影响　　 紫草素和拓扑替康作用U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞24h后,与对照组1,对照组2,对照组3,对照组4相比,紫草素和拓扑替康对四种细胞的Caspase3蛋白表达都具有显著的增强作用(P＜0.01)　　 八、紫草素和拓扑替康对U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞Caspase9蛋白表达水平的影响　　 紫草素和拓扑替康作用U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞24h后,与对照组1,对照组2,对照组3,对照组4相比,紫草素和拓扑替康对四种细胞的Caspase9蛋白表达都具有显著的增强作用(P＜0.01)　　 结论:　　 1、紫草素和拓扑替康分别显著抑制U251、U87、GSC-U251、GSC-U87细胞增殖,使G1与S期的RNA含量显著增多,阻止细胞进入G2期的作用。　　 2、紫草素和拓扑替康显著诱导U251、U87、GSC-U251、GSC-U87的凋亡,其机制与抑制bcl-2蛋白表达,促进Caspase3和Caspase9蛋白表达相关。