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研究背景:慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全世界函待解决的公共卫生难题。寻找新的治疗靶点是当前的研究热点和难点。大量研究表明,宿主的免疫系统在慢性HBV感染中发挥着重要作用,其中,Toll样受体(TLR)的表达抑制及其介导的天然免疫功能失衡也参与其中。TLR参与识别多种病原体,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。TLR7配体(TLR7-L)用于慢性HBV感染治疗,在小鼠、土拨鼠及黑猩猩模型中均显示出良好的应用前景。并且,我们前期实验也发现,TLR7-L刺激慢性乙型肝炎(CHB)患者的PBMC,可以抑制HepG2.2.15细胞内HBV复制。提示以TLR7为靶点的天然免疫应答调控,可以作为新的慢乙肝治疗研究方向。研究目的:检测TLR7在慢乙肝感染不同阶段的表达和与抗病毒治疗应答的关系,并进一步探讨其在CHB患者体内可能的抗病毒机制。研究方法:1.研究对象1.1横向研究:纳入3组共106例慢性HBV感染患者(34例免疫耐受[IT]、39例免疫活化[IA]及33例非活动性携带[IC])及31例健康对照(HC)。1.2纵向研究:纳入25例Peg-IFN-α-2a治疗的HBeAg+CHB患者,根据停药后24w是否仍具有HBeAg血清学转换及HBVDNA<1000 copies/mL分为持续应答组(SVR)和非持续应答组(NSVR)。2.动物建模6-8周龄雄性C57BL/6j小鼠,使用HBV1.2质粒和/或小鼠IFN-α-2a表达质粒高压尾静脉注射建模,联合/不联合尾静脉注射TLR7-L,定期监测sAg、eAg的表达,并检测肝内及脾内特异性及非特异性CD8+T细胞应答。3.实验方法外周血单个核细胞(PBMC)采用梯度离心法进行分离。TLR7及目的基因的表达使用realtime-RT-PCR进行测定。目的细胞亚群(CD19+B细胞等)使用流式分选及磁珠分选获得。细胞因子的分泌,细胞增殖、活化及抗体分泌等分别使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验、酶联免疫斑点测定法进行检测。研究结果1.横向研究慢性HBV感染时,IT组和IC组TLR7的表达明显低于HC组,而IA组TLR7的表达显著恢复。并且与ALT水平呈正相关。2.纵向研究25例Peg-IFN-α-2a治疗患者PBMC上TLR7的表达在治疗期间稳定增加,在第24周时,两组TLR7的表达具有明显的统计学差异,提示24周稳定高表达TLR7的患者可能更容易在治疗停止后获得持续应答。3.功能研究3.1 TLR7体外抗病毒效应TLR7-L刺激可以诱导PBMC分泌大量的IFN-α,且IA患者明显高于HC。将HepG2.2.15细胞暴露于TLR7-L刺激的PBMC上清,可以明显抑制HBV相关抗原表达。同时,IFN-α刺激可以上调PBMC中TLR7的表达,提示两者间存在相互促进的正反馈调节效应。3.2 TLR7对B细胞功能的影响TLR7在B细胞中高表达,使用IFN-α刺激后,B细胞上TLR7的表达显著增加。TLR7-L和IFN-α可以显著增加B细胞增殖、活化的能力和细胞因子、抗体的表达及分泌,且两者间存在明显的协同效应。3.3 TLR7体内抗病毒效应TLR7-L可以与IFN-α协同作用,明显增高小鼠肝内及脾内CD8+T细胞的频数,并有促进脾内特异性CD8+T细胞向靶器官肝脏募集的趋势。同时,协同刺激组肝内及脾内能够产生IFN-γ及TNF-α的特异性及非特异性CD8+T细胞频数也明显增加。结论:TLR7可以通过诱导IFN-α的分泌对HBV复制发挥抑制效应,而其表达和抗病毒作用在IA患者中均上调。此外,通过Peg-IFN-α-2a治疗,TLR7表达上调,24周时TLR7高表达可能与停药后的持续病毒学应答相关。并且TLR7-L可以与IFN-α协同作用增强B细胞的功能和慢性HBV感染小鼠体内CD8+T细胞应答。提示Peg-IFN-α-2a与TLR7-L序贯治疗策略在CHB患者中可能会具有很好的应用前景。