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研究背景内质网是蛋白质合成和折叠的主要场所。在生理条件下,蛋白质合成及其折叠能力处于平衡状态,这些蛋白质在内质网分子伴侣的陪伴下正确折叠及组装。当蛋白质合成速率超过蛋白质的折叠能力,未折叠蛋白或错误折叠蛋白大量积聚在内质网腔内,因此内质网稳态受到干扰使其处于应激环境,这种应激状态被称之为内质网应激,引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。UPR是一种适应性反应,在内质网应激初期,UPR可以促进内质网分子伴侣的激活,减少蛋白质的合成,从而恢复内质网稳态。当细胞内质网应激水平较高或长期处于内质网应激状态下时,UPR将不能恢复内质网稳态,这时UPR将激活凋亡信号通路诱导细胞凋亡。内质网应激在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病等疾病的发生中发挥重要作用。在2型糖尿病中,内质网应激与肝脏胰岛素抵抗的发生密切相关,它在扰乱糖脂代谢稳态中发挥重要的作用。肥胖可诱导内质网应激、肝脏脂质堆积和胰岛素抵抗,肥胖诱导的内质网应激通过激活JNK和其下游胰岛素受体的丝氨酸磷酸化水平损伤胰岛素信号通路,内质网应激已经被认为是肥胖时发生胰岛素抵抗的一个新的重要机制。糖尿病引起的内质网应激可减弱胰岛素信号通路,降低AKT磷酸化水平和IRS-1的酪氨酸磷酸化水平。抑制细胞色素P450 4A的表达可减轻小鼠肝脏内质网应激和胰岛素抵抗。同样的是,化学分子伴侣也可以改善2型糖尿病小鼠的内质网应激和葡萄糖稳态。内质网应激在胰岛素抵抗中发挥重要的作用,它可作为糖尿病的潜在治疗靶点。β-氨基异丁酸(β-aminoisobutyric acid,BAIBA)是一种非蛋白β-氨基酸,由支链氨基酸缬氨酸分解代谢产生,在线粒体内进一步降解为丙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶A。BAIBA通过增加小鼠肝脏的脂肪酸氧化和降低肝脏的脂肪从头合成来减少脂肪含量。BAIBA是肌肉细胞过表达过氧化酶增殖激活受体的转录辅助活化因子 1 α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 α,PGC-1 α)时分泌的一种小分子代谢产物。BAIBA通过过氧化物酶体增殖物激活受体 α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)增加白色脂肪的棕色化和肝脏的脂肪酸氧化,促成运动对代谢疾病的保护作用。最新研究发现,BAIBA通过AMPK-PPARδ通路改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗及炎症,促进其脂肪酸氧化。我们推测BAIBA可能对内质网应激存在重要的作用。本研究主要探讨BAIBA对2型糖尿病的内质网应激、凋亡和糖脂代谢异常的治疗作用。目的1.探讨BAIBA是否改善2型糖尿病小鼠肝脏糖脂代谢异常、内质网应激和凋亡;2.探讨BAIBA是否改善肝细胞内质网应激;3.探讨BAIBA改善内质网应激的分子机制。方法小剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)和高脂饮食(high fat diet,HFD)联合诱导2型糖尿病小鼠模型:将小鼠随机分为三组,每组7只。其中一组用来做对照组;另外两组用来诱导2型糖尿病,禁食四小时后,腹腔注射小剂量STZ(120mg/kg,溶解于PBS中,pH=4.0),三周后,将标准饮食(14.7kJ/g,13%的脂肪能量)替换为高脂饮食(21.8kJ/g,60%的脂肪能量),注射STZ八周后,这两组小鼠合并成一组,再随机分为两组,分别给予普通饮水(STZ/HFD组)和含有BAIBA(150mg/kg/d)的饮水四周(STZ/HFD-BAIBA组)。整个实验过程中,对照组小鼠一直给予普通饮食。衣霉素(tunicamycin)诱导的小鼠内质网应激模型:分别给予小鼠腹腔注射生理盐水或BAIBA(300 mg/Kg),0.5 h后,腹腔注射二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)或 tunicamycin(2.5mg/Kg)。腹腔注射 DMSO 或tunicamycin 2 h 后,取肝脏。氨基半乳糖/脂多糖(galacosamine/lipopolysacchaaide,GalN/LPS)诱导的小鼠凋亡模型:分别给予小鼠腹腔注射生理盐水或BAIBA(300mg/kg),0.5h后,腹腔注射PBS或GalN(700mg/kg)联合LPS(100μg/kg)。腹腔注射DMSO或GalN/LPS6h后,取肝脏。葡萄糖胺(glucosamine)诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型:HepG2细胞在含有18 mM的glucosamine中培养18 h后,加入BAIBA 10 μM处理24 h或48 h;高浓度葡萄糖(high glucose,HG)模拟2型糖尿病高糖环境的细胞模型:HepG2细胞在含有HG(30mM)培养液中孵育4h后加入BAIBA(10μM)培养 48h;毒胡萝卜素(thapsigargin)和tunicamycin诱导的HepG2细胞内质网应激:HepG2 细胞在含有 thapsigargin(1 μM)或 tunicamycin(3 μM)的 DMEM 中培养,4 h后分别给予BAIBA(1,10,100 μM)培养48 h。主要实验方法包括siRNA转染、细胞凋亡检测、胰岛素耐量实验、葡萄糖耐量实验、血清样本制备及生化指标检测、肝脏甘油三脂检测、蛋白提取和免疫印迹分析、RNA提取和Real-timePCR实验、冰冻切片油红0染色、石蜡切片HE染色、免疫组化、TUNEL染色。结果1.STZ/HFD-BAIIBA组小鼠肝脏重量和肝脏/体重比值较STZ/HFD组降低;2.STZ/HFD-BAIBA组小鼠空腹血糖值、肝脏糖异生关键酶表达水平较STZ/HFD 组降低,STZ/HFD-BAIBA 组小鼠磷酸化 Akt(Ser473)、磷酸化 IRS-1(Tyr632)和磷酸化IRS-1(Ser307)的蛋白表达水平较STZ/HFD组都得到改善;3.STZ/HFD-BAIBA组小鼠血清甘油三脂、总胆固醇、游离脂肪酸和低密度脂蛋白水平以及肝脏脂滴含量、脂肪从头合成基因表达水平均较STZ/HFD组降低,;4.STZ/HFD-BAIBA组小鼠肝脏CHOP、GRP78、ATF4蛋白表达水平,eIF2a和JNK磷酸化水平,Bax/Bcl2蛋白表达比值以及Caspase 3、Caspase 9 mRNA表达水平都较STZ/HFD组降低;5.BAIBA可下调葡萄糖胺、毒胡萝卜素、衣霉素和高糖诱导的HepG2细胞内质网应激标志性蛋白表达水平;6.预处理BAIBA可下调衣霉素诱导的小鼠肝脏ATF4蛋白表达水平和eIF2a磷酸化水平,并且下调半乳糖胺和脂多糖诱导的小鼠肝脏Caspase3和Caspase 9蛋白表达水平;7.siRNA敲除AMPK基因,BAIBA对eIF2α磷酸化水平和GRP78蛋白表达水平的抑制作用被阻断。结论1.BAIBA改善2型糖尿病小鼠肝细胞内质网应激和凋亡,以及肝脏糖脂代谢紊乱;2.BAIBA减轻葡萄糖胺、高糖、衣霉素和毒胡萝卜素诱导的HepG2细胞内质网应激,AMPK信号通路介导BAIBA的改善内质网应激效应。