引言神经干细胞具有自我更新能力和多分化潜能,一定条件下可分化逞神经系统的各种细胞,因此在修复受损神经组织方面有着良好的应用前景。通过神经干细胞移植,修复损伤坏死的脑、脊髓等组织,将是降低颅脑、脊髓损伤的有效途径。但是神经干细胞移植治疗脑、脊髓损伤的临床应用还面临着一些问题。其中检测和预防免疫排斥反应,始终是移植医学的核心任务。虽然现有的研究认为,中枢神经系统和神经干细胞具有一些特殊的免疫学属性,但神经干细胞要应用到临床,免疫排斥的研究就是不可避免的。本研究试图探究神经干细胞的免疫原性,及其相关的影响因素,为临床合理地利用神经干细胞修复损伤神经组织提供实验依据。第一部分小鼠神经干细胞体外培养和鉴定研究背景近十余年大量研究表明,成年哺乳动物脑内存在具有多分化潜能的神经干细胞,这一发现被认为是20世纪90年代神经科学领域研究最重要的进展之一。尽管研究者观察到,在自然条件下,体内极少量的神经干细胞对于损伤神经组织的自我修复贡献甚微,但众多学者相信通过体外大量扩增神经干细胞,从而能够达到,高浓度的神经干细胞移植,将在治疗脑、脊髓的创伤、梗塞及神经系统退行性变等众多疾病方面,具有充满希望的前景。成功进行高浓度神经干细胞移植,就要求从体外细胞培养中收获大量高纯度的神经干细胞。但是,自1992年建立神经干细胞悬浮培养法至今,虽经大量学者在实践中不断总结和改进,目前还有许多方面不尽人意。例如,数量、活力以及贴壁分化等。本实验借鉴了大量研究者的成功及失败的经验,总结了本实验室进行神经干细胞体外培养十年来的体会,探索了一套行之有效的神经干细胞培养及鉴定方法。材料和方法1材料实验动物BALB／c近交系新生鼠由浙江大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基、B27添加剂、胰蛋白酶均购于Gibco公司,表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购于Sigma公司。一次性塑料培养瓶为Orange公司产品。2方法2.1神经干细胞培养取BALB／c新生鼠,以戊巴比妥钠麻醉后处死(所有动物实验均按照大学动物实验委员会章程进行),解剖并分离海马组织,以PH为7.4的PBS缓冲液漂洗干净后,将组织碎片置于试管中,加入0.5g/L的胰酶和0.12g／L的EDTA,37℃消化15min,然后以玻璃吸管吹散,细胞计数显示,80%以上细胞活力良好。利用无血清培养基(DMEM/F12, B27 20 ml/L, EGF 20μg/L, bFGF 20μg/L),及琼脂糖包被的培养瓶,悬浮培养神经干细胞,传代并做单克隆扩增和分化。2.2神经干细胞鉴定应用CD133免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞。结果1神经干细胞培养神经干细胞培养第一天,呈单细胞悬液,第二天细胞逐渐聚集成小的神经球,第三天左右出现神经干细胞克隆,神经球逐渐增大,最终形成巨大神经球,中心神经干细胞因难以获得养分,此时需要重新消化,传代培养。2神经干细胞的鉴定无血清培养条件下,按克隆密度种植的神经干细胞分裂增殖逐渐形成克隆球,表明本实验组神经干细胞具有自我增殖能力。神经干细胞克隆球球在含10%胎牛血清的DMEM／F12培养基中培养,逐渐发生贴壁生长,并分化神经胶质细胞及少量神经元细胞,表明本实验组神经干细胞具有多向分化潜能。神经干细胞克隆球经经短时消化及机械吹散后,形成神经干细胞小克隆球及单细胞悬液,甩片收集后行CD133免疫荧光染色,均呈阳性,表明本实验组细胞均为神经干细胞。结论利用机械分离法和改进的酶消化法相结合的细胞分离培养方法,采用加入丝裂原的无血清培养基,及琼脂糖凝胶包被的培养瓶,选择适当的接种密度和传代培养时机,能够长期获得足够数量的高纯度神经干细胞。第二部分单向混合淋巴细胞培养试验检测小鼠神经干细胞与同一个体肝脏细胞免疫原性的差异研究背景近年来,随着细胞生物学及分子生物学技术的进展,神经干细胞移植日益成为神经科学研究的一个热点。神经干细胞具有自我更新和分化为神经元及神经胶质细胞的潜能,从而可以修复受损的神经组织。因此,神经干细胞在治疗神经创伤、梗塞及神经系统退行性变等众多疾病方面,具有着充满希望的前景,近年来经过众多学者的努力已经取得了一些令人振奋的成果。但神经干细胞移植技术最终要应用到临床,就不能回避免疫排斥的问题。在近十余年来的人类神经移植研究中,我们对神经系统的免疫学特性,了解还不是十分充分。本研究试图探讨小鼠神经干细胞免疫原性与自身肝脏细胞之间的差异,从而了解其免疫原性的强弱,以利于解决神经干细胞移植中的免疫排斥问题。材料和方法1材料实验动物C57BL／6近交系小鼠和BALB／c近交系新生鼠均由浙江大学实验动物中心提供。DMEM／F12培养基、B27添加剂、胰蛋白酶均购于Gibco公司,表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及丝裂霉素购于Sigma公司。一次性塑料培养瓶为Orange公司产品,氚标胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)购自Amersham Pharmacia Biotec。2方法2.1神经干细胞培养和鉴定取BALB／c新生鼠,以戊巴比妥钠麻醉后处死(所有动物实验均按照大学动物实验委员会章程进行),解剖并分离海马组织,加入0.5g/L的胰酶和0.12g/L的EDTA,37℃消化15min,然后以玻璃吸管吹散。利用无血清培养,悬浮培养神经干细胞,传代并做单克隆扩增和分化,应用CD133免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞。2.2主动免疫C57BL／6近交系小鼠将制备的NSCs,以丝裂霉素灭活后分别腹腔免疫C57BL／6小鼠15只,1×106细胞／只,1次／周,连续3周,最后1次免疫后第4天处死小鼠。2.3单向混合淋巴细胞培养试验无菌条件下摘取C57BL／6免疫小鼠小鼠脾脏,制备T淋巴细胞悬液。调整T淋巴细胞悬液密度为1x109／L,以每孔100μL体积加入圆底96孔板,作为应答细胞。然后将制备的C57BL／6小鼠神经干细胞,用培养液调整细胞密度为2x108／L后,丝裂霉素处理30 min,PBS洗涤后用培养液重悬,再按每孔100μl加入到已铺有受体淋巴细胞的96孔板中,作为刺激细胞。刺激细胞与应答细胞比例为1：5,使神经干细胞和淋巴细胞充分接触。再置于孵箱中培养120 h。培养结束前16 h,加入[3H]-TdR。2.4液闪计数仪检测以多头细胞收集仪将细胞收集到滤纸上,液闪计数仪检测细胞内掺入[3H]-TdR后形成的每分钟脉冲数,即cpm值,每组结果以3孔的平均值计算。2.5肝细胞对照组取BALB／c新生鼠,无菌条件下摘取肝脏,应用seglen灌流法制备肝细胞,上述同样方法腹腔免疫C57BL／6小鼠,收获T淋巴细胞。然后取同一批肝细胞,以丝裂霉素灭活后与收获T淋巴细胞行单向混合淋巴细胞培养,用[3H]-TdR标记并检测cpm值。2.6统计学处理计量资料用(?)+S表示,两组数据之间比较采用t检验。结果与肝细胞对照组比较,NSC组合成代谢中摄取的[3H]-TdR较少,因而液闪计数仪检测所得cpm值较小。两组cpm值的比较,P<0.001,其差异有统计学意义。结论综上所述,我们在实验中发现,小鼠神经干细胞免疫原性明显低于同一个体的肝细胞。长期的肝移植基础及临床研究表明,肝细胞具有较弱的免疫原性。因而我们有理由推测,神经干细胞的免疫原性低于其普通的体细胞。鉴于肝细胞的免疫原性已经得到广泛研究证实,所以本实验选择了肝细胞作为实验对照,但仅以肝细胞作为对照是不够的,因此这一方面尚有待于进一步深入研究。第三部分应用流式细胞术检测体外培养的神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达并比较炎症因子IL-2存在条件下MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达量的变化研究背景近年来,随着细胞生物学及分子生物学技术的进展,神经干细胞移植日益成为神经科学研究的一个热点。神经干细胞具有自我更新和分化为神经元及神经胶质细胞的潜能,从而可以修复受损的神经组织。因此,神经干细胞在治疗神经创伤、梗塞及神经系统退行性变等众多疾病方面,具有着充满希望的前景,近年来经过众多学者的努力已经取得了一些令人振奋的成果。但神经干细胞移植技术最终要应用到临床,就不能回避免疫排斥的问题。在近十余年来的人类神经移植研究中,我们对神经系统的免疫学特性,了解还不是十分充分。本研究试图检测体外培养的小鼠神经干细胞主要组织相容性抗原的表达量,以及炎症因子存在条件下其表达量的变化。从而了解小鼠神经干细胞免疫原性的特点,为临床解决神经干细胞移植中的免疫排斥问题提供实验依据。材料和方法1材料实验动物BALB／c近交系新生鼠均由浙江大学实验动物中心提供。DMEM／F12培养基、B27添加剂、胰蛋白酶均购于Gibco公司,表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及白介素-2购于Sigma公司。次性塑料培养瓶为Orange公司产品,小鼠MHC-Ⅰ单克隆抗体(FITC标记流式抗体)及小鼠MHC-Ⅱ单克隆抗体(PE标记标记流式抗体)均购自eBioscience。2方法2.1神经干细胞培养和鉴定取BALB／c新生鼠,以戊巴比妥钠麻醉后处死(所有动物实验均按照大学动物实验委员会章程进行),解剖并分离海马组织,加入0.5g/L的胰酶和0.12g/L的EDTA,37℃消化15min,然后以玻璃吸管吹散。利用无血清培养,悬浮培养神经干细胞,传代并做单克隆扩增和分化,应用CD133免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞。2.2流式细胞术检测神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达取生长良好的BALB／c神经干细胞1瓶,离心收集细胞,消化30分钟左右,间断轻轻吹打成单细胞悬液,离心收集细胞,SFM重悬细胞,移入流式试管,随机分为12管,细胞数约5000／管。先取2管分别加入“FITC标志的MHC-Ⅰ抗体／PE标志的同种型对照”和“PE标志的MHC-Ⅱ抗体／FITC标志的同种型对照”各1微升,设置机器本底。然后将其余10管离心后,加入FITC标记的anti-mouse MHCclassⅠ及PE标记的anti-mouse MHC classⅡ(I-A/I-E)各1微升,常温下作用15分钟。以PBS400微升洗涤一遍后,再以PBS400微升重悬,然后利用流式细胞仪检测NSC中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阳性细胞比例。取10管的平均值为神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阳性细胞比例。2.3流式细胞术检测炎症因子IL-2存在条件下神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达量的变化取生长良好的BALB／c神经干细胞3瓶,消化后接种入5ml培养瓶,共25瓶。随机分成5组,每组5瓶：按时间点(time line):24小时、3天、7天、14天,以10ng／ml的浓度,分别加入IL-2；另设阴性对照组(即不加IL-2)。收集各组细胞,移入流式试管,细胞数约5000／管。然后将各组细胞离后,每管加入FITC标记的anti-mouse MHC classⅠ及PE标记的anti-mouse MHC classⅡ(I-A/I-E)各1微升,分别标记MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ,常温下作用15分钟。然后利用流式细胞仪检测NSC中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阳性细胞比例。取5管的平均值为每组神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ阳性细胞比例。2.4统计学处理计量资料用(?)+S表示,两组数据之间比较采用t检验。结果1流式细胞术检测神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达结果显示,仅约18.46%增殖期NSC表达上述二类分子,而达81.54%的增殖期NSC没有检测到这二类分子的表达,且MHC-Ⅰ类分子的平均表达比例略高于MHC-Ⅱ类分子。2流式细胞术检测炎症因子IL-2存在条件下神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达量的变化结果显示,炎症因子IL-2存在条件下,各组与对照组相比,MHC-Ⅰ类分子及MHC-Ⅱ类分子的比例均有不同程度的上调, P<0.01,其差异有统计学意义。作用24小时至14天,4个时间点上,神经干细胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表达的变化未呈现明显的趋势。结论综上所述,我们在实验中发现,小鼠神经干细胞呈现较弱的免疫原性。在炎症因子IL-2存在条件下,MHC-Ⅰ类分子及MHC-Ⅱ类分子的比例均有不同程度的上调,但各个时间点上,其表达的变化未呈现明显的趋势。