【摘 要】
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既往我们研究发现,血红素氧合酶-1（HO-1）在内毒素急性肺损伤（ALI）中发挥重要内源性保护作用,但作用机制远未阐明。内质网应激（ERS）介导的细胞凋亡可能是参与肺损伤发病的重要环节,而HO-1对肺损伤时ERS调控作用及机制尚不清楚。为此,本研究主要探讨ERS介导的细胞凋亡在HO-1保护内毒素ALI中的作用及可能机制。为了探讨HO-1对内毒素急性肺损伤内质网应激介导细胞凋亡的作用及可能机制,我们
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既往我们研究发现,血红素氧合酶-1（HO-1）在内毒素急性肺损伤（ALI）中发挥重要内源性保护作用,但作用机制远未阐明。内质网应激（ERS）介导的细胞凋亡可能是参与肺损伤发病的重要环节,而HO-1对肺损伤时ERS调控作用及机制尚不清楚。为此,本研究主要探讨ERS介导的细胞凋亡在HO-1保护内毒素ALI中的作用及可能机制。为了探讨HO-1对内毒素急性肺损伤内质网应激介导细胞凋亡的作用及可能机制,我们从在体LPS诱导小鼠急性肺损伤模型和离体LPS攻击肺泡上皮细胞模型两个水平进行了研究,具体分为以下三个部分:第一部分:建立内毒素急性肺损伤小鼠模型,验证ERS介导的细胞凋亡参与内毒素ALI的发病过程:分别给与ERS抑制剂和诱导剂,测定ERS发生标志物（GRP78、ATF6、IRElα及PERK）及ERS相关凋亡蛋白（CHOP、caspase-12）的变化,观察肺损伤程度（氧合指数、肺损伤评分及肺组织湿/干重比）。第二部分:利用条件性肺HO-1基因敲除小鼠建立内毒素ALI模型,初步探讨HO-1对内毒素ALI时ERS介导细胞凋亡的影响及作用机制:与野生型小鼠比较,观察HO-1基因敲除小鼠肺组织ERS发生标志物（GRP78、ATF6、IRElα及PERK）蛋白表达、肺组织细胞凋亡、ERS相关凋亡蛋白（CHOP、caspase-12）的变化,测定HO-1基因和蛋白表达变化,测定肺组织中CO的含量,观察肺损伤程度（氧合指数、肺损伤评分及肺组织湿/干重比）。第三部分:利用离体大鼠肺泡Ⅱ型上皮模型,在细胞层面进一步明确HO-1调控ERS介导细胞凋亡可能的作用机制:利用LPS建立细胞内毒素攻击模型,观察HO-1基因沉默肺泡Ⅱ型上皮细胞ERS发生标志物（GRP78、IRElα及PERK）蛋白表达、细胞凋亡、ERS相关凋亡蛋白（CHOP、caspase-12）的变化,测定CO的含量和肺泡表面活性物质C（SP-C）表达。并探讨HO-1调控ERS介导细胞凋亡可能的信号通路:利用PERK、IRE1α抑制剂预处理大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞后加入LPS建立细胞模型,观察蛋白p-PERK、p-e IF2α、p-IRE1α、TRAF2、CHOP及caspase-12蛋白的表达。在实验一中,我们利用C57BL/6小鼠尾静脉注射LPS构建ALI模型,观察了不同LPS诱导剂量及诱导时间点时小鼠肺损伤情况、炎症因子指标和氧化应激指标的变化,最后选取LPS 15 mg/kg、诱导12h建立急性肺损伤模型。此外,我们利用ERS抑制剂TUDCA和激动剂衣霉素干预成功验证了ERS介导的细胞凋亡参与内毒素ALI的发病过程,为后续相关研究打下基础。由实验二我们发现,与野生型C57BL/6小鼠比较,HO-1-/-小鼠给予LPS 15mg/kg诱导12h后肺损伤程度加重,表现为肺损伤评分、肺W/D比值及BALF中总蛋白含量升高、氧合指数明显减低,凋亡指数（AI）升高,CO水平降低,肺组织ERS相关蛋白GRP78、p-PERK、及p-IRE1α表达水平升高,肺组织ERS凋亡蛋白CHOP、caspase-12 m RNA和蛋白表达显著升高。这些研究结果提示HO-1可能通过抑制ERS介导的细胞凋亡减轻LPS诱导的小鼠肺脏损伤。通过实验三我们发现,与动物实验结果一致,HO-1对内毒素攻击肺泡Ⅱ型上皮细胞有保护作用,HO-1可能通过抑制ERS介导的细胞凋亡减轻内毒素诱导的细胞损伤。进一步的机制研究发现,在肺泡Ⅱ型上皮细胞中,PERK抑制剂GSK2606414预处理减少了LPS诱导的GRP78、p-PERK、p-e IF2α及CHOP蛋白表达,IRE1α抑制剂GSK2850163预处理减少了LPS诱导的p-IRE1α、TRAF2及凋亡蛋白caspase-12的表达,结合HO-1基因沉默可导致GRP78、p-PERK、p-e IF2α、CHOP、p-IRE1α、TRAF2、caspase-12蛋白表达水平升高及细胞凋亡增多的结果,提示HO-1可能通过PERK/e IF2α/CHOP和IRElα/TRAF2/caspase-12通路抑制细胞凋亡。由此,我们得出结论ERS介导的细胞凋亡参与内毒素诱导的ALI过程,HO-1可能通过ERS中PERK/e IF2α/CHOP、IRElα/TRAF2/caspase-12通路抑制细胞凋亡从而减轻LPS诱导的急性肺脏损伤。HO-1调控ERS介导细胞凋亡的其它机制尚有待进一步的研究。
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