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目的: 结核分枝杆菌进入宿主巨噬细胞时诱导大量表达的Hsp16.3有助于结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内成为滞留菌,本实验通过建立结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞的模型,探讨研究结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的关系。 方法: 1.分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株感染巨噬细胞RAW264.7细胞株,于感染后1、3、6及12h,利用激光共聚焦显微镜鉴定卡介苗及结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染RAW264.7巨噬细胞模型。 2.用流式细胞技术于上述各时间点检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其时相性变化。利用PCR技术扩增模型目的基因,Western-Blot技术比较研究Hsp16.3于上述各时间点蛋白表达水平的时相性变化。 结果: 1.激光共聚焦显微镜下观察到RAW264.7巨噬细胞内有标记MTB16KD的绿色荧光,证实结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型构建成功。 2.巨噬细胞感染结核分枝杆菌后,凋亡率升高,H37Rv组与BCG组感染巨噬细胞的凋亡率同一时间点比较,其中1h、3h、12h有统计学意义(P<0.05)。 3.巨噬细胞感染结核分枝杆菌后,PCR扩增产物在435bp处可见特异性条带,Hsp16.3蛋白表达升高,H37Rv组与BCG组Hsp16.3蛋白表达水平同一时间点比较,其中1h、3h有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.成功建立了RAW264.7巨噬细胞的结核分枝杆菌感染模型。 2.结核分枝杆菌感染可导致巨噬细胞凋亡,感染巨噬细胞的凋亡率与菌株毒力强弱有关,毒力弱的结核分枝杆菌感染的巨噬细胞早期凋亡更显著。 3.不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞,诱导巨噬细胞凋亡水平的不同可能与它们诱导产生的Hsp16.3水平不同有关,毒力强的结核分枝杆菌感染巨噬细胞,感染巨噬细胞早期表达Hsp16.3更显著。 4.结核分枝杆菌毒力的强弱、MTBHsp16.3被诱导表达水平均与宿主巨噬细胞的凋亡有关。