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糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之一,也是目前全球导致终末期肾病最危险的因素之一。所以在糖尿病肾病和慢性肾脏病中需要有效及创新的治疗阻止其病理进程。晚近已证实氧化应激和炎症反应是导致糖尿病肾病肾脏损害的重要因素,因此通过抑制氧化应激和炎症反应可作为治疗的新靶向。临床研究证实单味中草药、经方等在糖尿病肾病治疗中的有效性。本研究通过应用经方加减治疗糖尿病肾病,旨在对中医药延缓糖尿病肾病病理进程进行深入的分子机制研究。研究内容分为四个部分:1.糖尿病肾病大鼠模型建立及组织形态学观察目的:采用单侧肾切除及一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法构建大鼠糖尿病肾病(DN)模型,通过观察大鼠一般情况及肾组织病理形态变化来验证栝楼瞿麦汤对糖尿病肾病有治疗效果,且能延缓其病程进一步进展方法:100只SD大鼠购回后适应性饲养1周,除正常组外,所有大鼠以单侧肾切除及腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(45mg·kg-1)的方法诱导制作大鼠糖尿病肾病(DN)模型。注射STZ72h后,测定随机血糖≥16.7mmol·L-1者,确定造模成功。按随机数字法将其分为DN模型组、栝楼瞿麦汤高剂量组(GLQM-H)、栝楼瞿麦汤中剂量组(GLQM-M)、栝楼瞿麦汤低剂量组(GLQM-L)、阳性药物(缬沙坦)对照组。从第四周起,GLQM-L、GLQM-M、GLQM-H 分别予以 1.4 g·kg-1,2.8 g·kg-1,5.6g·kg-1 中药,缬沙坦组予 4.8×10-3g·kg-1,正常组及模型组均给予2.8g·kg-1蒸馏水连续灌胃12周,分别在治疗第4周、第12周时称量大鼠体质量、予大鼠空腹8小时后尾尖采血0.5mL左右,测定大鼠空腹血糖值。末次给药12h后,颈椎脱位法处死大鼠,观察大鼠一般情况、取大鼠肾组织进行常规石蜡切片以进行H E、PAS染色并在光镜下观察各组大鼠病理组织形态学变化。其余肾组织储存于液氮中备用,余石蜡切片常温保存备用。结果:正常组大鼠的毛发均匀,毛色正常,活动正常,一般情况如常;模型组大鼠毛发稀疏,毛色枯黄,并出现多饮、多食、多尿、消瘦、精神萎靡、弓背等表现;各治疗组大鼠在实验过程中,毛色及毛发分布情况较模型组均有不同程度改善;DN模型组大鼠与正常组大鼠比较,肾组织出现明显的病理进展;各治疗组与DN模型组比较,肾组织病理变化均有不同程度的改善。结论:栝楼瞿麦汤对糖尿病肾病大鼠损伤的肾组织有修复作用。2.栝楼瞿麦汤对糖尿病肾病大鼠炎症因子的影响目的:探讨栝楼瞿麦汤对糖尿病肾病大鼠炎症因子的作用机制方法:取第一部分储存于液氮中的备用肾组织,取组织匀浆提取的上清液用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定各组大鼠肾组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素生长因子(IGF)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量。结果:DN模型组大鼠肾组织bFGF、IGF、MCP-1含量均高于正常组,差异显著(P<0.01);GLQM-H、GLQM-M 的 bFGF、GLQM-M 组的 MCP-1、缬沙坦组 bFGF、IGF、MCP-1 含量均低于DN组,有显著性差异(P<0.01);GLQM-L的bFGF、GLQM-M的IGF、GLQM-H的MCP-1均低于DN组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:栝楼瞿麦汤通过调控bFGF,IGF,MCP-1等炎症因子的表达来改善糖尿病肾病大鼠表现及其肾组织病理状态。3.栝楼瞿麦汤干预糖尿病肾病大鼠p38 MAPK炎症信号通路机制研究目的:研究栝楼瞿麦汤对糖尿病肾病大鼠p38MAPK信号通路影响,探讨其对糖尿病肾病的作用机制及治疗效果方法:取第一部分储存于液氮中的备用肾组织,分别提取大鼠肾组织蛋白及RNA,Western Blot法检测大鼠肾组织p-p38 MAPK、p-CREB、FN蛋白表达情况。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠肾组织FNmRNA基因表达情况。结果:DN模型组大鼠与正常组大鼠比较,p-p38MAPK、p-CREB、FN蛋白表达水平显著上调(P<0.05);FN mRNA基因表达水平显著上升(P<0.05);经栝楼瞿麦汤干预后,DN大鼠肾组织中p-p38 MAPK、p-CREB、FN蛋白表达水平均有不同程度下调且FN mRNA基因表达水平也随之下调,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:栝楼瞿麦汤通过抑制p38 MAPK炎症信号通路中关键信号分子的激活,使损伤的DN大鼠肾组织得以修复,从而延缓DN的进程。4.栝楼瞿麦汤干预糖尿病肾病大鼠TGF-β1/Smad炎症信号通路机制研究目的:研究栝楼瞿麦汤对糖尿病肾病大鼠TGF-β1/Smad信号通路影响,探讨其对糖尿病肾病的作用机制及治疗效果方法:取第一部分储存于液氮中的备用肾组织及备用的预处理组织切片,组织匀浆液分别提取其全组织蛋白及RNA,免疫组织化学法检测大鼠肾组织Smad2、Smad3蛋白表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测大鼠肾组织TGF-β1mRNA1、Smad2mRNA和Smad7 mRNA基因表达情况;Western Blot法检测大鼠肾组织Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达情况。结果:DN模型组大鼠与正常组大鼠比较,TGF-β1mRNA、Smad2mRNA基因表达显著上调、Smad7 mRNA基因表达显著下调(P<0.01),Smad2及Smad3蛋白表达明显增加,Smad7蛋白表达显著下调(P<0.01)。各治疗组与模型组相比较,TGF-β1mRNA及Smad2 mRNA基因表达下调(P<0.01),Smad7mRNA基因表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05),Smad2及Smad3蛋白表达下降、Smad7蛋白表达升高。结论:栝楼瞿麦汤能能通过抑制TGF-β1/Smad炎症信号通路中关键信号分子的激活,使DN大鼠损伤的肾组织得以修复,从而延缓DN的进程。