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T淋巴细胞介导的免疫反应在器官移植排斥中占有关键地位。许多证据表明T细胞在移植排斥发生、发展阶段都具有十分重要的作用。T细胞的活化需要“双信号”系统:T细胞受体（T cell receptor,TCR）/主要组织相容性复合体（maior histocompatibilitycomplex,MHC）提供活化的第一信号;APC和T细胞表面的共信号分子提供第二信号,缺乏第二信号,将导致T细胞无反应,诱导免疫耐受。共信号分子表达于T细胞表面,其与配体结合不仅能增强T细胞与抗原递呈细胞（APC）的连接及促进TCR与MHC抗原肽复合物的结合,还可向T细胞传递其完全活化所必须的辅助信号。T细胞不同的共信号通路组成了相互影响、相互依存的多层次级联调控网络,为调控T细胞活化及其介导的免疫应答提供了有效的靶点,将T细胞作为靶细胞通过各种途径阻断其活化是免疫治疗的可行方案。B和T细胞衰减分子（B and T lymphocyte attenuator,BTLA）是共信号分子免疫球蛋白超家族的最新成员,与CTLA-4有一定的同源性,为抑制型受体。疱疹病毒进入调节子（herpesvirus entry mediator,HVEM）是BTLA唯一的配体,属于TNFR家族的成员。研究发现HVEM—BTLA可介导抑制信号的传递,抑制T细胞的增殖和细胞因子的表达,且这一抑制功能的发挥具有TCR复合物依赖性。主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子可将外源性抗原递呈给T辅助细胞,引起抗原特异性T细胞的活化,MHCⅡ类分子表达的调控主要在转录水平,其中反式作用因子（MHCⅡtransactivator,CⅡTA）是MHCⅡ类基因表达的“分子开关”,决定着MHC-Ⅱ类分子的存在与否及表达程度,也决定了免疫应答的本质。因此CⅡTA是对MHC-Ⅱ类分子递呈抗原过程进行干预的理想靶点,可以在自身免疫损伤和移植排异过程中进行免疫抑制干预。基于上述两个方面,本研究构建了HVEM融合蛋白真核表达体系,并对表达产物的结构进行了鉴定,然后以自行制备的HVEM-Ig融合蛋白为工具激活BTLA-HVEM通路、抑制TCR/CD3复合物介导的T细胞激活;同时联合给予携带了CⅡTA突变体的重组腺病毒,通过CⅡTA突变体竞争性抑制野生型CⅡTA的生物学活性,促使MHCⅡ类分子表达降低,在体内体外观察其对T细胞的作用,为后续探讨其应用于移植排斥反应的可行性提供实验支持。第一部分HVEM-Ig融合蛋白真核表达体系的建立及表达产物的鉴定为了对HVEM-BTLA这一共信号通路进行深入研究,我们构建了鼠HVEM胞外区和鼠IgG2a Fc段重组真核表达质粒,并在CHO细胞中实现了HVEM-Ig融合蛋白的稳定分泌性表达。首先RT-PCR从BALB/c小鼠脾细胞总RNA中扩增HVEM胞外区片段,WT-1杂交瘤细胞总RNA中扩增鼠IgG2a Fc片段,连入真核分泌型表达载体pSecTagA,获得重组质粒pSecTagA-HVEMIg。将重组质粒pSecTagA-HVEMIg用脂质体转染CHO细胞,Hycromycin B加压筛选,建立稳定表达HVEM-Ig的CHO细胞库。用Mouse IgG ELISA试剂盒检测各细胞克隆的表达量,筛选表达量大于1pg/cell·24h的细胞克隆进行保留;再进行稳定性实验,最终保留5个连续三次检测结果均大于1pg/cell·24h的克隆,用于大规模转瓶扩增。高表达细胞克隆进行大规模转瓶细胞培养,细胞扩增期用含10%FCS的1640培养基培养,并保持Hygromycin B筛选压力,待细胞长满转瓶后,换无血清培养液培养5-7天,收集上清液。利用ProteinA与目的蛋白IgG2aFc段特异性结合的性质,采用rProtein A-Sepharose FF亲和层析,快速获取目的蛋白。将获得的目的蛋白进行结构确认实验,证实表达产物为HVEM-Ig融合蛋白:SDS-PAGE在还原状态下检测到约45 kD的特异蛋白,而在非还原状态下可检测到约90 kD和120kD的两种特异蛋白,说明表达产物为二聚体或三聚体形式,符合HVEM-Ig融合蛋白的表达形式。Western Blot分析该样品可被抗鼠HVEM抗体特异性识别,证明该蛋白为HVEM-Ig融合蛋白。第二部分:携带CⅡTA突变体的腺病毒的制备、扩增及纯化以及体外活性检测CⅡTA突变体基因的获得是以小鼠Ⅳ型CⅡTA基因的cDNA片段为模板通过PCR-SOE的方法构建N端缺失第325-678位碱基的突变体。然后通过同源重组的方法获得携带CⅡTA突变体的腺病毒骨架pAd-CⅡTA,转染入HEK293细胞扩增后获得完整的重组腺病毒颗粒Ad-CⅡTA。用CsCl密度梯度超速离心的方法对重组腺病毒进行纯化,并用TCID50法计算病毒滴度。然后将纯化的重组腺病毒Ad-CⅡTA感染HeLa细胞,用流式细胞术观察介导表达的CⅡTA突变体抑制诱导型MHC-Ⅱ类分子表达的作用。结果显示用重组腺病毒Ad-CⅡTA感染HeLa细胞株,使IFN-γ诱导表达MHC-Ⅱ类分子的细胞阳性率比对照组下降40～45%,平均减少42.5%;平均荧光强度降低62～67%,平均下降64.5%。说明重组腺病毒Ad-CⅡTA介导的CⅡTA突变体基因转移可以抑制细胞表面诱导型MHC-Ⅱ类分子表达。第三部分HVEM-Ig融合蛋白的体外功能研究及其联合CⅡTA突变体的体内研究丝裂霉素处理的C57BL/6鼠脾细胞,与BALB/c鼠T细胞混合,加入不同浓度HVEM-Ig或对照IgG,进行混合淋巴细胞反应（MLR）,结果:[3H]-TdR掺入法显示HVEM-Ig呈剂量依赖性的抑制同种T细胞增殖（HVEM-Ig终浓度为150μg/ml时抑制率约50%）（P＜0.05）,而IgG对同种T细胞的增殖没有影响。HVEM-Ig组培养上清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-10的水平均低于于未处理和对照IgG组（P＜0.05）,IL-4的水平各组没有明显差异。用CD3抗体和亚剂量CD28刺激BALB/c鼠T细胞,加入HVEM-Ig或对照IgG,3H-TdR掺入法观察T细胞增殖情况,结果同MLR结果类似,上清中各细胞因子分泌水平同前述实验符合。收集同样处理的T细胞经穿膜后用流式抗体进行标记,观察胞内细胞因子分泌情况,HVEM-Ig处理组同对照组相比胞内IL-10表达降低。利用新型荧光染料CFSE体内研究HVEM-Ig联合CⅡTA突变体对同种异体T细胞免疫功能的抑制作用。CFSE具有与活体细胞结合并随细胞分裂荧光强度系列减半的特性,通过流式细胞术实现对体内细胞8至10个分裂周期的可视化,成为研究体内环境下淋巴细胞增殖情况的新技术。取BALB/C鼠T细胞体外用CFSE染色后尾静脉输入经9 Gy Co60辐照后的C57BL/6鼠体内,在第0,2天注射HVEM-Ig融合蛋白和重组腺病毒Ad-CⅡTA,对照组注射IgG和空载病毒Ad-GFP。3天后杀C57BL/6鼠取脾和淋巴结细胞流式观察。结果发现同对照组相比实验组CD4+T、CD8+T细胞增殖明显减低。这些结果提示联合应用HVEM-Ig和CⅡTA突变体可以抑制同种异体T细胞的活化和增殖。结论:本课题成功构建了HVEM-Ig融合蛋白真核表达体系,表达及纯化HVEM-Ig融合蛋白,并对蛋白的结构进行了鉴定,为后续实验提供了研究工具。在此基础上将已构建好的携带CⅡTA突变体基因的重组腺病毒骨架转染HEK293细胞扩增,获得完整的重组腺病毒颗粒Ad-CⅡTA,并体外验证了其活性。实验结果表明在体外单独应用HVEM-Ig融合蛋白可以抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌,CⅡTA突变体重组腺病毒可以抑制MHCⅡ类分子的表达。最后体内联合应用纯化的HVEM-Ig融合蛋白和重组腺病毒Ad-CⅡTA,发现了其抑制同种异体T细胞的活化和增殖的功能,为进一步在动物移植模型中探讨其作用打下了基础。