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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。NDV主要侵害禽类,是危害我国禽养殖业的重要病原之一。NDV强毒株感染可诱导产生大量的IL-1β,引起强烈炎症反应,导致动物发病和死亡。IL-1β可增加IL-6、IL-8和血管细胞粘附分子等的合成和释放,活化淋巴细胞、促进白细胞、嗜酸性粒细胞向炎症部位浸润,是炎症反应的中心介质。适量的IL-1β可帮助机体清除病毒,修复损伤,但过量的IL-1β表达则会增加炎症反应程度,加重机体损伤。以往研究主要集中在不同毒力NDV诱导的炎症反应差异,但IL-1β对NDV诱导的炎症反应的影响及NDV诱导IL-1β表达的分子机制仍较少报道。1-磷酸鞘氨醇受体1（Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1PR1）是治疗炎性疾病的重要靶标,在哺乳动物研究中已证实,S1PR1可调节病毒感染引起的炎性细胞浸润及炎性细胞因子的表达,但在家禽中,S1PR1信号通路在病毒感染诱导的炎症反应中的作用仍不清楚。本实验室前期研究发现,抑制或过表达S1PR1后可显著调控NDV诱导的IL-1β表达,表明S1PR1可能通过调节促炎性细胞因子表达改变NDV感染诱导的炎症反应程度,但S1PR1通过何种机制调控IL-1β仍不清楚。基于以上问题,本课题在前期研究的基础上,从NDV体内/外感染入手,选择适当的细胞、S1PR1信号通路分子和IL-1β介导的炎症反应为研究对象,使用过表达、基因功能干扰或抑制等方法,从不同的层次和角度解析NDV/NDV病毒组分、S1PR1信号通路和IL-1β介导的炎症反应之间的关系,以期揭示S1PR1调节IL-1β表达的信号传导通路及其对NDV致病能力的影响。本研究主要包括以下内容:1.NDV诱导的IL-1β在病毒感染致病中的作用本研究选取不同毒力NDV毒株感染SPF鸡,观察不同毒力毒株感染后动物临床症状、体温变化和死亡情况;收集感染后3 d的脏器,制备病理切片观测其炎症反应程度;并检测各脏器内NDV增殖及炎性细胞因子的表达情况。发现NDV强毒株感染后动物体温明显升高,临床发病急,症状明显,死亡率可达100%,机体多组织器官出现炎性损伤,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子大量表达,在炎症反应较强烈的组织内,IL-1β蛋白水平较高;弱毒株感染后临床症状轻微,体温在感染后第1 d微弱升高后即恢复正常,不引起死亡。进一步使用IL-1β中和抗体治疗NDV强毒株GM感染的鸡,并检测其脏器内IL-1β组织分布,鸡体温变化和死亡率,发现与攻毒对照组相比,IL-1β中和抗体可有效降低肺和腺胃中NDV感染诱导的IL-1β水平,缓解因NDV感染引起的体温升高,使死亡率由100%降低至71.4%。2.NDV通过NLRP3/caspase-1炎性小体和MAPK信号通路诱导IL-1β表达为明确参与NDV诱导IL-1β表达的宿主分子,本章中我们通过使用基因过表达、沉默或抑制剂的方法分别检测了NLRP3、caspase-1、ERK、p38和JNK/MAPK对GM诱导的IL-1β的影响。结果显示,NDV强毒株GM可在SPF鸡及禽类细胞中诱导NLRP3/caspase-1炎性小体和MAPK信号分子的活化;过表达NLRP3可使GM诱导的IL-1β表达水平升高至169.3 pg/m L,明显高于转染p CA后接毒组（113.8 pg/m L）,用Si-NLRP3作用后,GM诱导的IL-1β表达水平由152.8 pg/m L降低到87.1 pg/m L;抑制caspase-1后,GM感染诱导的IL-1β表达由127.5 pg/m L降低至58.9 pg/m L;抑制ERK/MAPK后,NDV诱导的IL-1β无明显降低;抑制p38/MAPK后,IL-1β由113.0pg/m L降低至64.9 pg/m L,抑制JNK/MAPK后,NDV诱导的IL-1β由124.0 pg/m L降低至90.5 pg/m L,均具有显著差异,表明NDV可通过NLRP3/caspase-1炎性小体、p38/MAPK和JNK/MAPK信号分子诱导IL-1β表达。3.NDV基因组RNA可通过NLRP3/caspase-1诱导IL-1β表达为探究参与NDV诱导IL-1β表达的病毒组分,本研究用紫外灭活GM毒株作用DF-1细胞,并以正常病毒感染为对照组,发现紫外灭活GM病毒不能在细胞上诱导IL-1β表达。随后,我们构建了GM-V和GM-W基因的真核表达质粒,同时获取了GM病毒基因组RNA,转染细胞发现,GM-V抑制IL-1β表达,GM-W转染后IL-1β有微弱升高,但无统计学差异;GM RNA诱导IL-1β的表达水平最高可达93.5 pg/m L,显著高于同时间点空白对照组,表明GM RNA可诱导IL-1β表达。在本论文第三章研究的基础上,我们进一步检测了GM RNA对NLRP3、caspase-1、p38和JNK/MAPK的活化情况,发现GM RNA可活化NLRP3/caspase-1炎性小体,但对p38和JNK/MAPK的活化作用较弱。过表达NLRP3可使GM RNA刺激产生的IL-1β由85.3 pg/m L升高至108.5 pg/m L,抑制NLRP3后,IL-1β由86.5 pg/m L降低为42.7 pg/m L;抑制caspase-1活性后,GM RNA诱导产生的IL-1β由87.9 pg/m L降低至64.6 pg/m L,表明NLRP3/caspase-1参与GM RNA诱导的IL-1β表达。4.S1PR1通过NLRP3/caspase-1调节NDV诱导的IL-1β表达为明确S1PR1调节NDV诱导IL-1β表达的分子机制,本研究检测S1PR1激动剂SEW2871作用后NDV诱导的IL-1β表达变化,发现SEW2871刺激可使NDV诱导的IL-1β表达由121.5 pg/m L升高至135.5 pg/m L,使用W146抑制剂后,IL-1β蛋白浓度由115.3 pg/m L降低至75.8 pg/m L。在第三章的研究基础上,本研究进一步检测了S1PR1对NLRP3、caspase-1、p38和JNK/MAPK的活化情况,发现S1PR1激动剂SEW2871作用后NLRP3和caspase-1活性显著增加,p38和JNK/MAPK活化无明显增加,抑制剂W146可降低NLRP3和caspase-1的活性,但对p38和JNK/MAPK无明显降低作用,表明S1PR1可活化NLRP3/caspase-1炎性小体,进一步调节IL-1β的表达。本课题根据NDV临床发病特点,结合国内外最新研究进展,在前期研究的基础上,对S1PR1参与NDV诱导IL-1β表达的分子机制进行研究,主要发现了IL-1β中和抗体可降低NDV强毒株GM感染引起的发病及死亡;NDV可通过宿主NLRP3/caspase-1炎性小体、p38和JNK/MAPK信号分子促进IL-1β产生;GM基因组RNA可诱导IL-1β表达,该过程依赖于NLRP3/caspase-1炎性小体的活化;进一步研究证明,S1PR1可通过NLRP3/caspase-1炎性小体调控NDV诱导的IL-1β表达。该研究进一步丰富了NDV感染致病的分子机制,从家禽病毒性疾病的角度揭示了S1PR1调节动物炎症反应的作用机制,为新城疫防控提供科学的理论指导。