药用植物次生代谢产物的合成受到各种环境因子的调控,有研究表明环境胁迫能促进次生代谢产物的积累。但是,植物本身是一个复杂的系统,存在多种环境反应或调控机制,所以用植株进行次生代谢产物研究存在一定困难。药用植物的细胞培养在一定程度上解决了这个问题,起到了降阶降维的作用。欧洲花楸悬浮细胞因其生长迅速、反应灵敏,常用于研究联苯类次生代谢产物。本课题以欧洲花楸Sorbus ccuczpcrricz L的悬浮细胞为研究对象,通过测定细胞生物量及次生代谢产物的变化趋势,就非生物诱导子重金属及生物诱导子酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞的影响进行研究。主要研究内容包括：1、欧洲花楸悬浮细胞生长曲线培养研究2、非生物诱导子重金属对欧洲花楸悬浮细胞生物量及次生代谢产物合成和积累的影响研究3、生物诱导子酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞的影响研究4、复合诱导子重金属及酵母提取物对欧洲花楸悬浮细胞的影响研究结果：1、本实验测定了欧洲花楸悬浮细胞在正常培养条件下的生长20d的生长周期及细胞悬浮液的pH值,确定了欧洲花楸悬浮细胞的生长周期。欧洲花楸悬浮细胞在培养至14d时,细胞鲜重达到最大值,在培养的1-5d内,细胞处于延滞生长期；5-14d内,细胞处于指数生长期；14-20d内,细胞处于生长平台期。在正常培养条件下,细胞悬浮液的pH值的变化趋势是越来越大。利用细胞的鲜重和干重分别对欧洲花楸悬浮细胞的进行生长曲线的拟合,结果表明Logistic函数的R2值最大,为0.969,表明该函数拟合度很高,能够描述欧洲花楸悬浮细胞生长曲线的变化。拟合得到的函数是f(x)=5.044/(1+23,34*exp(-0.3887*x))。对该函数求一阶及二阶导数,得到了欧洲花楸悬浮细胞在8d时,细胞的生长速率最大；在5d时,生长加速度最大。细胞生长至第5d时,是细胞指数生长的前期,在此时期可对细胞进行诱导子处理。2、用重金属来诱导欧洲花楸悬浮细胞,考察细胞在处理后生物量及次生代谢产物的变化情况。结果表明,镧、铜、铅诱导子对细胞生物量都有不同程度的影响。当镧诱导子浓度在1μg/L-10mg/L之间时,对细胞生物量表现为刺激作用,刺激作用的大小呈现出中间浓度高,两端浓度低的变化趋势,镧对细胞生物量刺激作用最大的浓度为10μg/L(P<0.05)。铜诱导子对细胞生物量的影响和诱导时间相关,铜的0.05mg/L浓度对细胞生物量一直表现为抑制作用。低浓度在诱导时间<96h时,表现为抑制作用,之后则表现为促进作用,高浓度在诱导时间<96h时,表现为促进作用,之后则表现为抑制作用,铜对细胞生物量刺激作用最大的浓度为50mg/L(P<0.05)。铅浓度中0.5mg/L、5mg/L、50mg/L对细胞生物量表现为刺激作用(P<0.05)。在镧、铜、铅诱导下欧洲花楸悬浮细胞没有合成成次生代谢产物。3、用酵母提取物来处理欧洲花楸悬浮细胞,研究其对细胞生物量、次生代谢产物、细胞悬浮液pH值及细胞内可溶性蛋白质含量的变化。结果表明,在YE的诱导下,欧洲花楸悬浮细胞的生物量表现出下降的趋势,细胞生物量理论值和实际值之间的差值随着诱导时间的延长而增大；细胞悬浮液的pH值表现出下降的趋势；在诱导后的12h时,欧洲花楸悬浮细胞内即可检测到aupuparin,细胞内次生代谢产物的浓度随诱导时间而变化；处理细胞中的可溶性蛋白质含量高于对照组,在诱导时间<96h时,其含量是对照的50%,当诱导时间>96h时,其含量是对照的144%(P<0.05)。4、在镧+YE的复合诱导子处理下,镧诱导子的低浓度和高浓度对细胞总生物量是有增加的刺激作用,浓度为0.1μg/L、20mg/L的镧和10mg/L的铜对YE诱导子对细胞生物量的抑制有拮抗作用。镧+YE、铜+YE、铅+YE影响联苯类物质的方式和程度与的浓度密切相关,其影响方式为：刺激或抑制次生代谢物的合成含量；使处理细胞合成某种化合物的最大值显著高于YE单独诱导；提前在YE诱导时合成某一化合物的峰值时间。其中,铜+YE处理细胞内化合物合成的浓度表现出和铜诱导子浓度相关,随着铜浓度升高而升高或下降,这种相关且和诱导时间有关；铅+YE处理细胞内化合物合成的浓度表现出和铅诱导子浓度相关,其中是呈现出V字形变化趋势,最低点是YE+0.5mg/L；另外是随着铅浓度增大,化合物的浓度也随之增大。结论：1、通过对欧洲花楸悬浮细胞生长特性的研究,得到了欧洲花楸悬浮细胞的生长函数符合logistic曲线,该函数为f(x)=5.044/(1+23.34*exp(-0.3887"x)),细胞在14d时进入增长平台期,在8d时生长速率达到最大,在细胞生长至第5d时可添加诱导子进行处理。2、重金属诱导子镧、铜、铅的处理浓度对欧洲花楸悬浮细胞的生物量均有不同程度的影响,这种影响程度与诱导子浓度及诱导时间长短有关。整体上随着浓度增加,镧对细胞鲜重表现为抛物线形,铜、铅表现为U形曲线,对细胞生物量促进作用最大的浓度分别为镧10μg/L、铜50mg/L、铅0.5mg/L。但是这三种诱导子在所有实验浓度下都不能直接诱导欧洲花楸悬浮细胞合成联苯类物质。3、酵母提取物能够快速诱导欧洲花揪悬浮细胞产生联苯类物质,经鉴定化合物为：2’-OH-aucuparin,3,5-dihydroxy-biphenyl, noraupuparin, aucuparin, eriobofuran。欧洲花楸悬浮细胞对YE具有特异性反应,当细胞受到胁迫时,细胞会启动抗胁迫途径来应对逆境。发现欧洲花楸次生代谢产物合成会导致细胞生长的抑制,这一现象的发生伴随着蛋白质含量及pH值之间的变化。细胞在产生次生代谢产物的同时,细胞鲜重显著下降并且随刺激时间的增加下降比率越大。经检测伴随细胞鲜重下降,培养体系pH值也明显下降、细胞内可溶性蛋白质的含量明显增加。因此判断pH值变化和防御蛋白合成可能是造成细胞鲜重下降的主要原因。4、在开展了生物、非生物诱导对欧洲花楸影响的基础上,首次模拟自然界的情况,开展了生物和非生物复合诱导对欧洲花楸悬浮细胞生长和次生代谢产物合成和积累的影响研究。发现了欧洲花楸细胞生长、次生代谢产物合成随环境胁迫强度(浓度)及时间变化规律。虽然重金属不能直接诱导联苯类物质产生,但是重金属可以通过其它机制调控次生代谢产物的合成。在研究YE和三种重金属复合诱导时,发现镧和铜元素能够增加YE诱导下细胞的鲜重,铅元素使得YE诱导下细胞鲜重进一步降低,表明镧、铜对YE胁迫有拮抗作用,而铅对YE胁迫有协同作用。三种元素的起效时间均与浓度相关,低浓度诱导下,起效时间在96-132h,中间浓度在48-72h,高浓度在12-24h。镧元素不影响YE诱导次生代谢产物合成的趋势,但是镧元素可以提高次生代谢产物合成量,在镧浓度是1μg/L时,显著(与YE相比,p<0.05)提高了eriobofuran的合成量,镧浓度是10mg/L时,诱导noraupuparin明显增加。铜元素可以使YE诱导次生代谢产物合成峰值的时间提前,在铜浓度为0.5mg/L时,使aucuparin合成峰值从132h提到72h。次生代谢产物合成量与铜浓度相关,随着铜浓度增加,次生代谢产物合成量逐渐减少。对于noraupuparin,在0.5mg/L诱导下合成量是50mg/L诱导下的6.5倍。铅元素对YE诱导次生代谢产物合成与浓度相关,浓度为0.05mg/L、0.1mg/L时,化合物合成的量的趋势是下降,浓度为5mg/L、100mg/L时,化合物合成的量的趋势是上升,浓度为0.5mg/L时,化合物合成量的最低。