肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一,在许多地区尤其是非洲和亚洲,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染被认为是HCC发生的一个高危因素,许多慢性HBV感染者最终发生严重的肝脏疾病包括慢性肝炎、肝硬变和肝细胞癌,这些疾病目前每年导致约75万人死亡。HBV感染后不同个体对HBV的自发清除能力有很大的差异,青少年和成年人在感染HBV后大部分个体能产生强大的抗病毒反应,最终清除病毒;而小部分(大约5%-10%)不能清除病毒而转变为慢性病毒携带者,或进一步发展为慢性肝炎;新生儿在感染HBV后90%以上发展为慢性肝炎。已知HBV的清除是由一种包括干扰素和其他一些细胞因子在内的非溶细胞机制所介导,但干扰素诱导的HBV DNA清除的确切机制现在还不清楚。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3(apolipoprotein BmRNA-editing catalytic polypeptide-like protein 3,APOBEC3)是哺乳动物所特有的胞嘧啶脱氨酶,目前已发现至少有7个成员:A3A、A3B、A3C、A3D/E、A3F、A3G和A3H。APOBEC3具有针对多种逆转录病毒和内源性逆转录元件的强大的天然免疫功能,但这种效应能被HIV-1病毒产生的病毒感染因子(virion-infectivity factor,Vif)所抑制。在病毒逆转录过程中,APOBEC3能使病毒负链DNA上的特定胞嘧啶碱基(C)脱去氨基转变成尿嘧啶碱基(U),这种突变能引起下列两种结果:(1)含有U的病毒负链DNA被激活的尿嘧啶DNA糖基化酶识别并移去U,产生无碱基位点,可抑制病毒正链DNA的合成或被细胞内的核酸内切酶所降解;(2)如果含有U的病毒负链DNA逃避了尿嘧啶DNA糖基化酶的作用,则能作为模板合成正链DNA,从而使病毒正链DNA产生G→A超突变。这种超突变可产生成熟前终止密码子或高度突变的无功能病毒蛋白,从而抑制病毒的复制。APOBEC3的胞嘧啶脱氨基作用往往好发于逆转录病毒单链形式的负链DNA上。HBV基因组结构为一部分环状、一部分呈单链的双链DNA。在该病毒的生活周期中也需经历逆转录过程,期间也存在单链DNA的形式。因此,APOBEC3是否也能像抑制逆转录病毒一样抑制HBV的负链DNA引起了研究者们的兴趣。最近已有研究证实,多个APOBEC3成员对HBV都有抑制作用,有些表达能被干扰素所诱导,提示它们可能参与了HBV的非溶细胞性清除机制。但关于APOBEC3抑制HBV的具体作用机制目前还不清楚。因此,本研究拟从体外转染实验入手,了解APOBEC3中哪些成员对HBV基因复制和表达具有明显抑制作用;进一步用免疫共沉淀方法得到与APOBEC3相作用的结合蛋白,用蛋白质谱技术分析鉴定结合蛋白,深入研究其在HBV基因复制和表达中的地位。另外,检测各种细胞系和组织中APOBEC3的表达情况以及被干扰素诱导的能力,以及APOBEC3蛋白在细胞内的定位。以期揭示APOBEC3体内抑制HBV的机制,从而有助于探索一些能增强这种HBV抑制能力的新治疗思路。本研究分为以下三部分:第一部分体外细胞系中APOBEC3对HBV复制的抑制本研究第一部分旨在了解APOBEC3家族中哪些成员对HBV core相关DNA水平具有抑制作用,同时对HBsAg和HBeAg的表达是否也有抑制作用,哪些成员能被包装入HBV病毒颗粒,从而有利于进一步探索APOBEC3抑制HBV的作用机制。首先,我们对APOBEC3蛋白对HBV HBsAg和HBeAg基因表达的影响进行了一系列研究。通过体外瞬时共转染实验,分别将HBV表达质粒与A3B或A3G真核表达质粒或对照空载体pcDNA3.1共转染人肝癌细胞系HepG2中,应用电化学发光法(ECLIA)测定转染48hr后细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示,A3B能在蛋白水平上抑制HBsAg和HBeAg的表达。共转染A3B和HBV表达质粒的HepG2细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg水平分别为对照组的3216±15.43%和43.07±13.88%,明显低于对照组(P＜0.05)。而共转染A3G和HBV表达质粒的HepG2细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg水平分别为对照组的89.54±5.08%和88.51±5.33%(P＞0.05),两组之间无显著性差异(P＞0.05)。为揭示A3B抑制HBV基因表达的机制,我们继而分析了上述转染细胞中HBs的RNA表达。提取上述共转染48hr后HepG2细胞总RNA,通过半定量RT-PCR方法检测HBs mRNA水平,结果显示,共转染A3B和HBV表达质粒的HepG2细胞中的mRNA水平与对照相比明显降低,提示A3B能抑制HBs mRNA的表达。随后,为检测A3B对HBs mRNA的抑制是否发生在转录水平,我们将HBV S基因的启动子序列克隆进含荧光素酶报告基因的载体——pGL-2中,并用该质粒与对照载体pcDNA3.1或A3B或A3G表达质粒共转染293T细胞,结果显示A3B能明显抑制HBV S基因启动子的活性(P＜0.01),而A3G对其活性的抑制不明显(P＞0.05)。因此,A3B对HBsAg在蛋白水平和RNA表达上都有抑制作用,而且至少有一部分作用是发生在转录水平。既然A3B能抑制HBV基因启动子活性,是否也能影响其他病毒启动子活性呢?我们将SV40和CMV等病毒启动子的质粒与APOBEC3表达质粒体外共转染293T细胞,结果发现,A3B对CMV启动子介导的GFP的表达和SV40启动子介导的新霉素磷酸转移酶Ⅱ的表达都有抑制作用,而对两种非病毒启动子如人核糖体蛋白L32启动子和延长因子1启动子介导的GFP表达并无抑制效应。其他APOBEC3蛋白包括A3G对这两种病毒启动子介导的基因表达无明显抑制作用。这提示A3B对病毒启动子活性的抑制作用可能是特异的,A3B可能具有广谱的抗病毒功能。为观察APOBEC3蛋白对HBV core DNA合成的影响,我们将HBV质粒与多种APOBEC3真核表达质粒或对照空载体pcDNA3.1共转染HepG2细胞,提取和纯化转染48hr后细胞内的HBV core DNA,并应用定量PCR方法对其定量。结果发现在APOBEC3家族中,除A3A外,A3B、A3G、A3F和A3C都能不同程度地抑制HBV core相关DNA的合成,其中,以A3B和A3G的抑制作用最为强大,而且呈现一定的量效关系,当A3B或A3G质粒与HBV质粒等比例(各1ug)共转染HepG2细胞时,分别能将HBV core DNA水平降低至对照的9.14±4.42%和21.27±4.46%,而当A3B或A3G质粒4ug与HBV质粒1ug(质粒质量比为4∶1)共转染HepG2细胞时,分别能将HBV core DNA水平降低至对照的1.50±0.71%和6.58±3.19%。A3F和A3C对HBV core DNA水平则有中等程度的抑制作用,当质粒质量比为1∶1共转染时,A3F和A3C能将HBV core DNA水平降低至对照的59.48±2.65%和60.37±20.49%,当质粒质量比为4∶1共转染时,A3F和A3C能将HBV core DNA水平降低至对照的3.15±0.30%和26.86±1.02%。而A3A并不能明显抑制HBV core DNA水平。上述结果提示我们,A3B是一种强大的机体天然抗HBV分子,它对HBV复制具有双重抑制作用:一方面对HBV core DNA合成具有比A3G更为强大的抑制作用,另一方面还对HBsAg和HBeAg在蛋白水平和RNA表达上也具有抑制作用:既能降低分泌的HBsAg和HBeAg蛋白水平,又能减少HBV S基因mRNA水平和S基因的启动子活性。此外,A3B还可抑制CMV和SV40等其他病毒启动子介导基因表达的活性,提示A3B可能具有广谱抗病毒作用。A3G虽然对HBV core DNA也有强大的抑制作用,但却不能明显抑制HBsAg的表达,对HBV S基因的启动子活性也无明显抑制作用。因此推测,A3B抗HBV的作用机制可能不同于A3G。已知部分APOBEC3蛋白能被包装入HIV-1病毒颗粒中从而发挥抑制效应,故而我们也检测了A3B是否也能被包装入HBV病毒颗粒中。我们用带HA标签的APOBEC3真核表达质粒瞬时转染HepG2.2.15细胞,分离、纯化转染后细胞培养上清中的HBV病毒颗粒,提取病毒蛋白,应用抗HA抗体通过Western Blot方法鉴定是否有转入的质粒蛋白的表达。结果我们在HBV病毒颗粒中分别检测到了A3B-HA和A3G-HA蛋白的表达,但却检测不到A3A-HA蛋白的存在,提示了A3B和A3G能被包装入新产生的HBV病毒颗粒中,而A3A则不能被病毒颗粒所包装。这一结果与它们对HBV的抑制作用相符合。第二部分A3B与haRNP K的相互作用及其抗HBV机制的研究本研究第一部分结果提示了A3B是一种强大的机体天然抗HBV分子,可能具有不同于A3G的独特的抗病毒机制。而目前对体内可能与A3B相互作用的分子研究得很少,对A3B可能的抗HBV作用机制还不清楚。为此,本部分研究从寻找体内能与A3B相结合的蛋白入手,继而研究和证实A3B与结合蛋白、结合蛋白与HBV之间的可能联系,从而探索A3B可能的抗HBV机制。我们首先将A3B-HA真核表达质粒瞬时转染293T细胞,利用抗HA抗体通过免疫共沉淀方法获得了一个能与A3B蛋白相互作用的大小在60-70KD左右的特异性蛋白质条带,经质谱和Western Blot鉴定为hnRNP K蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K protein)。而且用类似的方法发现hnRNP K所属的hnRNP家族其他成员包括hnRNP I、hnRNP C1/C2、hnRNP H/F和hnRNP A/B也能与A3B结合。并且A3B是APOBEC3家族中主要与hnRNP家族蛋白结合的成员,其他成员如A3A、A3G和A3F与上述几种hnRNP家族蛋白不结合,A3C仅与hnRNP I和hnRNP K很弱地结合。而相比之下,A3B与几种hnRNP蛋白都有较强的结合。另一方面,我们先用抗hnRNP K抗体免疫共沉淀、再用抗HA抗体Western Blot方法反向证实了A3B与hnRNP K的结合。hnRNP K是一种已知蛋白,属于hnRNP家族成员,可与多种分子结合,包括RNA、单链和双链DNA和蛋白质等,其相互作用分子参与了染色体重构、基因转录、mRNA剪接、mRNA稳定性和翻译等过程。最近的研究发现,hnRNPK能通过与HBV增强子Ⅱ(EnhancerⅡ,EnhⅡ)序列结合从而调节HBV的复制效率。HBV EnhⅡ位于HBV核心基因ORF的上游,对病毒3.5kb的RNA的转录起着正性调节作用。因此我们进一步研究了在EnhⅡ介导的HBV基因表达中A3B和hnRNP K之间可能的相互作用。293T细胞高表达内源性的hnRNP K蛋白,可作为hnRNP K蛋白的来源,用pcDNA3.1或A3B-HA的表达质粒转染。转染后提取细胞总核蛋白,用吸附在磁珠上的EnhⅡdsDNA探针免疫共沉淀,沉淀用于Western Blot分析。结果用pcDNA3.1转染的细胞总核蛋白经EnhⅡdsDNA免疫沉淀后可以检测到hnRNP K蛋白,但转染A3B表达载体的细胞总核蛋白经EnhⅡdsDNA免疫沉淀后却未检测到,提示了A3B可能抑制了细胞内hnRNP K与HBV EnhⅡ的结合。为验证这一结果,我们在体外检测了A3B蛋白对重组蛋白GST-hnRNP-HA与EnhⅡdsDNA结合的影响。我们构建了GST-hnRNP K-HA原核表达质粒,在细菌中诱导表达并纯化、鉴定。纯化的GST-hnRNP K-HA蛋白首先与结合在磁珠上的EnhⅡdsDNA探针结合,然后与表达A3B-HA的转染后293T细胞核蛋白孵育;随后将EnhⅡdsDNA-蛋白复合物洗脱下来,用于Western Blot分析。结果显示,经A3B-HA蛋白处理后的EnhⅡdsDNA-hnRNP K复合物中的hnRNP K蛋白水平明显降低,提示体外实验中A3B蛋白也能抑制重组蛋白hnRNP K与EnhⅡdsDNA的结合。上述结果提示,A3B对HBV基因表达的抑制可能部分是发生在细胞转录水平,通过抑制hnRNP K蛋白与EnhⅡ之间的相互作用来实现的。由于hnRNP K是一种RNA结合蛋白,继而研究RNA是否介导了A3B与hnRNPK之间的联系。纯化的GST-hnRNP K蛋白首先与EnhⅡdsDNA探针结合,然后与经RNase A处理过的或未经处理过的转染了A3B表达载体的293T细胞核蛋白提取物共同孵育,洗脱特定的蛋白复合物用于Western Blot分析。结果显示,RNase处理后并没有改变hnRNP K与A3B的结合强度,提示了hnRNP K与A3B之间的联系是非RNA依赖的。第三部分A3B在细胞内的表达、亚细胞定位及其调控研究这部分研究检测了APOBEC3在多种细胞、组织中的表达情况,并观察IFN刺激对A3B表达的影响,另外还研究了APOBEC3蛋白在细胞内的分布,旨在进一步揭示APOBEC3在体内表达的调控和作用。首先应用半定量RT-PCR方法检测了以下一系列组织和细胞系中APOBEC3的表达情况:正常肝组织中A3B的表达:来自3例健康肝供体的肝组织全部检测到了A3B的表达,3例肝转移性肿瘤病人的非肿瘤肝组织中有2例检测到了A3B的表达,表达水平总体较低,并且表达有明显的个体差异。正常人外周血单个核白细胞中A3B基因的表达:8例健康成人外周血单个核白细胞中A3B的表达存在着个体差异,有2例未检测到A3B的表达,3例呈较低水平的表达,有3例表达较强。进一步将不表达或低表达A3B的4例外周血单个核白细胞分离出来用植物血凝素(PHA)刺激24hr后再检测A3B的表达,结果2例低表达A3B的标本经PHA刺激后表达有所增高,1例不表达的经PHA刺激后出现较弱的表达,另1例不表达A3B的标本经刺激后仍为阴性表达。多种细胞系中A3B的表达:A3B在正常肝细胞系QSG-7701中表达很低,在7株肝癌细胞系中全部表达,其中有3株肝癌细胞系HepG2、SMMC7721和HepG2.2.15呈高表达。在多种其他肿瘤细胞系包括白血病细胞系(K562、KU812、NB4、Jurkat、U937)、胃癌细胞系(AGS)、宫颈癌细胞系(Hela)、肠癌细胞系(RKO、SW480、SW620)和Hek293细胞中,除Jurkat、Hela、RKO和NB4细胞系不表达或低表达A3B外,多数肿瘤细胞系中均有A3B高水平的表达。提示A3B在肿瘤细胞系中的表达要高于正常细胞。配对肝癌和癌旁肝组织中的APOBEC3家族基因和HBV基因的表达:29对配对肝癌或癌旁肝组织中,A3G和A3F呈散发性的低表达,在两种组织中表达无显著性差异。而在A3B表达阳性的26例肝癌或癌旁肝组织中,有24例显示出A3B在肝癌中的表达明显高于癌旁肝组织,这种表达的差异有统计学意义(P＜0.05)。这29例肝癌患者中有10例同时伴有HBV感染,临床血清学检测证实有HBsAg和HBcAb阳性。于是进一步分析了这10例肝组织中APOBEC家族基因和HBV基因的表达,结果这10例全部表达A3B,并且A3B普遍在肝癌组织中高表达,而癌旁肝组织不表达或表达很弱(P＜0.01)。而HBX基因和HBsAg蛋白的表达方式与A3B恰好相反,10例癌旁肝组织均表达或较强表达HBX基因和HBsAg蛋白,而相应的肝癌组织则表达很弱甚至不表达,差异具有显著性(P＜0.01)。这一结果进一步证实了A3B的抗HBV功能。另外,A3B在肝癌中的表达明显高于癌旁肝组织,在多种肿瘤细胞系中表达水平较高,而在正常肝组织中常低表达,提示了,A3B的异常活化和高表达可能与肝癌的发生有关。最近一些研究报道,在人巨噬细胞和肝细胞中,IFN-α刺激能诱导多种APOBEC3蛋白如A3A、A3B、A3F和A3G的表达。因此,我们检测了IFN刺激在原代肝细胞和一些肝来源的细胞系中对A3B表达的效应。在2例原代肝细胞中,A3B呈弱表达。经IFN-α刺激后,A3B的表达明显增高,但增高的程度有所不同。在正常肝细胞系QSG-7701和肝癌细胞系HepG2、QGY-7703、BEL-7402和Huh7中,IFN-α和IFN-β都可以诱导A3B表达上调。其中,IFN-α在10IU/ml至1000IU/ml之间的浓度、作用时间在24至48hr之间可显著诱导A3B表达升高,而且这种表达的诱导呈剂量依赖性和时间依赖性。IFN-β在1ug/ml和2ug/ml浓度、作用12 hr到24hr之间也可以诱导A3B在HepG2细胞内表达升高,然而效率要比IFN-α要低。本研究中Ⅱ型干扰素IFN-γ则未能诱导HepG2细胞中A3B表达的上调。由于A3B在原代肝细胞和多种肝来源的细胞系中的表达能被IFN-α和IFN-β刺激而上调,故推测在机体抗HBV感染过程中,可能通过IFN-α和IFN-β诱导肝细胞内A3B的表达上调,从而发挥抑制或清除HBV病毒的作用,也即A3B可能参与了体内干扰素诱导的肝脏非溶细胞性HBV清除机制。从上述结果得知,A3B在原代肝细胞、正常肝组织和外周血单个核白细胞中的表达具有明显的个体差异性,并且在原代肝细胞中对干扰素刺激表达上调的能力也有所不同,由此提示我们,这种A3B表达和调控的个体差异可能是HBV感染后出现不同临床结果的原因之一。最后,为了解APOBEC3在细胞内的分布情况,我们用各APOBEC3-HA表达质粒转染HepG2和HepG2.2.15细胞,利用抗HA抗体行免疫荧光染色,荧光显微镜下进行观察。在两种细胞系中A3G和A3F都定位于细胞浆内。A3B在两种细胞内的定位有所变化,HepG2细胞中A3B主要定位于肝细胞核内,HepG2.2.15系能持续复制HBV基因组的HepG2细胞,在HepG2.2.15细胞内A3B则主要定位于胞浆,部分胞核也有着色。A3A和A3C在两种细胞的胞浆和胞核中都有表达。总结1、A3B是一种强大的机体天然抗HBV分子。IFN-α和IFN-β能诱导A3B在肝细胞中的表达,诱导效应具有时间和剂量依赖特征。被诱导表达上调的A3B对HBV复制具有双重的抑制作用:一方面对HBV core DNA合成具有强大的抑制作用,另一方面还对HBV HBsAg和HBeAg在蛋白水平和RNA表达上也具有抑制作用。2、hnRNP K蛋白是细胞内与A3B相互作用的主要蛋白之一。A3B抑制HBV的可能机制之一是通过与hnRNP K蛋白的相互作用抑制hnRNP K与HBV EnhⅡ序列的结合,从而影响着对HBV的转录和复制的调控。3、除HBV外,A3B还可抑制CMV和SV40等其他病毒启动子介导基因表达的活性,提示A3B可能具有广谱抗病毒作用。4、A3B在肝癌组织中的表达明显高于癌旁肝组织,并且在多种肿瘤细胞系中表达水平较高,而在原代肝细胞、正常肝组织中表达水平较低,提示A3B异常活化和高表达可能与肝癌的发生有关。伴有HBV感染者肝癌组织中A3B的表达明显高于癌旁肝组织,而HBX基因和HBsAg蛋白的表达却明显低于癌旁肝组织,与A3B的抗HBV功能一致。5、A3B在原代肝细胞、正常肝组织以及外周血单个核白细胞中的表达具有个体差异性,并且在原代肝细胞中对干扰素刺激表达上调的能力不同,可能与HBV感染后出现不同的临床结果有关。