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食源性生物活性肽是极具发展前景的功能因子,具有丰富生物活性。核桃长期以来被认为具有改善学习记忆的功能,其健脑益智生物活性成分除不饱和脂肪酸、维生素外,蛋白质及生物活性肽也被认为是重要成分之一,但其作用机制仍需进一步探究。与核桃蛋白质相比,多肽因其分子量小、吸收率等优势而备受关注。本论文旨在从核桃蛋白酶解物中筛选具有改善认知功能的生物活性肽,通过体外稳定转染Aβ-E22G-mCherry质粒构建Aβ蛋白聚集细胞模型和体内学习记忆障碍小鼠模型评价其生物活性,探究核桃蛋白生物活性肽对学习记忆改善作用机制及不同给予方式对其功效发挥的影响。本论文首先采用D-半乳糖(D-gal)诱导的学习记忆损伤小鼠模型评价核桃蛋白酶解物(WPH)改善学习记忆能力,发现WPH可有效改善D-gal小鼠对空间和有害刺激的学习记忆能力。WPH具有显著提高D-gal小鼠血清中抗氧化酶(SOD和GSH-Px)活性、抑制脑组织中一氧化氮合酶(NOS)活性以及显著降低氧化产物(MDA和NO)含量的作用;体外Aβ蛋白聚集细胞模型证实WPH可显著抑制细胞内Aβ蛋白聚集(p<0.05),以上结果表明WPH中含有具有改善学习记忆能力的生物活性肽。经高效液相色谱分析发现WPH中多肽分子量主要集中在1 500 Da以下;通过超高液相色谱和高分辨质谱联用从WPH中鉴定得到10条多肽片段,序列简写如下:ASACM(AM5)、PPKNW(PW5)、ASSAPE(AE6)、GGPATTC(GC7)、HCPF(HF4)、HSGPHA(HA6)、NGGSH(NH5)、WSREEQE(WE7)、MTDAN(MN5)和WPPKN(WN5)。结合多肽物理性质预测分析,从10条多肽中挑选4条(WN5、PW5、WE7和HF4)进行体外抗Aβ蛋白聚集活性初筛和验证,其中PW5肽的抗Aβ蛋白聚集活性最佳。利用APP/PS1转基因小鼠评价核桃蛋白肽PW5体内改善学习记忆能力的生物活性。行为学结果表明,PW5肽干预可有效改善小鼠在水迷宫和穿梭实验中对空间和有害性刺激的学习记忆能力。免疫组织化学染色结果显示,PW5肽干预后APP/PS1小鼠脑中Aβ淀粉样蛋白沉积(15.5±1.08,p<0.05)明显低于对照组Aβ淀粉样蛋白沉积(25.14±3.89)。16S rRNA检测结果表明,PW5肽可调整APP/PS1小鼠处于失调状态下肠道菌群的α和β多样性及组成。此外,PW5肽可促进血清中神经递质肾上腺素(NE)水平的上升以及乙酰胆碱(Ach)和丁酸水平的降低(p<0.05)。Pearson系数分析表明,血清神经递质和短链脂肪酸水平变化与肠道菌群中Lactobacillus、g_norank_f_Erysipelotrichaceae、Flexispira等菌属的相对丰度变化存在显著相关性。在对PW5肽改善学习记忆功效的作用机制研究过程中,探讨了肠道菌群对AD发病的影响。研究发现,采用几种抗生素(氨苄西林、甲硝唑、万古霉素、新霉素、庆大霉素和红霉素)联合干预可有效杀灭3月龄APP/PS1小鼠肠道中的绝大部分菌群,使其接近无菌状态以便后续粪便移植研究;与同月龄(5月龄)未经干预的APP/PS1小鼠相比,短期抗生素干预对Aβ淀粉蛋白沉积形成无明显影响。在抗生素干预的基础上,通过移植老年(16月龄)APP/PS1小鼠的粪便菌群,可重构肠道微生物菌群多样性和组成,导致小鼠脑中(5月龄)Aβ斑块数量显著增加(p<0.05)。这些结果提示外界干预可通过调整肠道菌群的组成来实现预防、改善和治疗AD。结合行为学、免疫荧光染色、肠道菌群及代谢组学结果,PW5肽的作用机制可能是通过降低脑内Aβ淀粉样蛋白斑块并改变肠道微生物群和血清代谢物组成起到改善APP/PS1小鼠的学习记忆损伤作用。通过灌胃和腹腔注射PW5肽对APP/PS1小鼠进行干预,评价两种不同给予方式对其改善学习记忆损伤的影响。研究发现,PW5肽经口服给予后其改善APP/PS1小鼠认知功能障碍和减少Aβ蛋白沉积的效果明显优于腹腔注射。与腹腔注射方式相比,PW5肽口服可接触肠道菌群,对认知功能障碍的APP/PS1小鼠肠道菌群多样性、组成及功能均有很好的调整作用,使其整体组成远离未经干预的APP/PS1小鼠而更接近于野生型小鼠。本研究表明核桃蛋白具有改善学习记忆损伤的功效,并证实核桃蛋白源生物活性肽PW5肽经口服干预后其改善认知功能障碍的效果明显优于腹腔注射。基于本研究结果,不仅拓宽了核桃蛋白潜在的应用范围,提高其附加的经济、营养和医用价值;而且核桃蛋白源生物活性肽可进一步开发为改善学习记忆功能性食品或药品,在预防、改善和治疗认知障碍相关的多种疾病方面具有良好的应用前景。