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研究背景及目的:随着老龄化进程的加快,以帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)为代表的神经退行性疾病日益受到重视,已经成为一个重要的公共卫生问题。环境因素在神经退行性疾病发生、发展过程中发挥着重要作用。神经炎症在中枢神经系统(central nervous system,CNS)退行性病变过程中发挥着关键作用,其中最为重要的是小胶质细胞活化。活化的小胶质细胞释放多种可溶性的因子包括自由基(活性氧自由基和氮类自由基)、细胞因子以及脂代谢产物等,参与神经退行性疾病的发生发展过程,而各种环境因素同样被证实通过小胶质细胞介导的炎症诱导神经系统损伤并进一步参与神经退行性疾病的发生过程。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是最典型的诱导小胶质细胞活化的环境毒物,已被大量应用于探讨炎症在神经退行性改变中的作用。探讨LPS诱导小胶质细胞活化的分子机制,对于神经炎性相关疾病的防治将起到积极的推动作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是锌依赖的肽链内切酶,参与调控细胞基质组成,并且参与了对多种细胞表面分子、趋化因子、细胞因子等功能的调控。在中枢神经系统,MMPs的重要生理功能是参与神经元可塑性的调控;而在病理条件下,MMPs是调控小胶质细胞介导炎症反应的重要因子。CD147是重要的基质金属蛋白酶诱导因子。近年来的研究显示,CD147参与了免疫功能尤其是巨噬细胞功能的调控以及多种炎性相关疾病的发生、发展过程。作为中枢神经系统的驻留型免疫细胞,小胶质细胞与巨噬细胞在多方面存在相似,其活化是否受到CD147的调控值得关注。在本研究中,我们对CD147在LPS诱导小胶质细胞活化过程中的作用进行了探讨;同时,从下游MMPs的角度初步探讨了CD147调控LPS诱导的小胶质细胞活化的分子机制,结果可为LPS为代表的外源性毒物所致神经炎性损伤的干预提供新的理论依据以及可能的靶点。研究内容:1.探讨CD147在小胶质细胞活化过程中的作用利用BV2小胶质细胞系,建立LPS诱导小胶质细胞活化的体外模型。采用qRT-PCR和Western blot方法检测在LPS诱导BV2细胞活化过程中CD147的表达变化。在此基础上,为了探讨CD147是否参与了LPS诱导的小胶质细胞活化,通过shRNA-CD147慢病毒载体构建干扰CD147表达的BV2细胞模型,并进一步检测干扰CD147对LPS诱导的IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性相关因子以及COX-2/PGE2表达/释放的影响。2.探讨MMPs在CD147诱导小胶质细胞活化过程中的作用通过建立的LPS诱导BV2小胶质细胞活化模型,首先运用qRT-PCR和Western blot法检测LPS诱导BV2细胞活化过程中MMPs的表达改变。进一步利用MMPs抑制剂抑制MMPs的活性,观察对LPS诱导的BV2细胞炎性相关因子表达的影响。为了探讨MMPs是否参与CD147调节LPS诱导的小胶质细胞活化过程,进一步观察干扰CD147对LPS刺激下BV2细胞中MMPs变化的影响。3.探讨褪黑素对LPS诱导小胶质细胞活化过程中CD147/MMPs的影响褪黑素的神经保护已众所周知,通过前几部分的研究,初步证实了CD147/MMPs在LPS诱导的小胶质细胞活化过程中的作用。在本部分研究中,我们进一步探讨了褪黑素是否可能通过对CD147/MMPs的作用而影响LPS诱导的小胶质细胞活化。首先利用MTT法筛选了褪黑素的最佳干预浓度,然后检测了褪黑素对LPS诱导的BV2细胞活化的影响。为了探讨褪黑素对LPS诱导BV2细胞活化过程中CD147和MMPs表达的影响,采用qRT-PCR和Western blot法检测其mRNA和蛋白表达水平。在此基础上,通过Western blot方法检测褪黑素对CD147表达以及小胶质细胞活化关键的上游MAPK/NF-κB通路的影响。研究结果:1.通过建立体外模型,探讨了CD147在LPS诱导的小胶质细胞活化过程中的作用MTT结果显示,不同浓度的LPS对BV2小胶质细胞活力无显著影响,qRT-PCR和Western blot实验结果显示,LPS诱导BV2小胶质细胞炎性活化相关因子IL-6、IL-1β、TNF-α以及COX-2的mRNA及其蛋白表达水平显著升高,且与LPS浓度(0.05、0.1、0.5、1μg/mL)呈剂量-效应关系,提示建立了LPS诱导小胶质细胞活化的体外模型。进一步的研究发现,LPS处理组CD147 mRNA和蛋白表达水平都明显上调,提示LPS诱导BV2细胞中CD147的表达。干扰CD147表达后LPS诱导的BV2细胞活化相关因子IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达和释放受到显著抑制;同时,COX-2及其下游效应因子PGE2的表达水平均显著降低。综合上述结果,提示CD147可能参与了LPS诱导的小胶质细胞活化过程。2.MMPs在CD147诱导小胶质细胞活化过程中的作用qRT-PCR和Western blot实验结果显示,LPS诱导BV2细胞中MMP-3、MMP-8mRNA和蛋白表达显著上调。抑制MMPs的活性后,LPS诱导的IL-6、IL-1β以及TNF-α表达和释放均下调;并且,COX-2/PGE2的表达也受到抑制(表现为COX-2的mRNA和蛋白表达水平以及PGE2释放的下降)。上述结果验证了MMPs可参与调节LPS诱导的小胶质细胞活化。进一步通过干扰CD147的BV2细胞模型,结果显示,抑制CD147的表达可显著下调LPS作用下MMP-3、MMP-8的mRNA和蛋白表达水平,提示CD147可通过调节MMPs进一步调节LPS诱导的小胶质细胞活化过程。3.褪黑素可能通过对CD147/MMPs的作用影响LPS诱导的小胶质细胞活化过程褪黑素可在不影响BV2细胞活力的同时显著抑制LPS诱导的BV2细胞活化,并且显著抑制COX-2/PGE2的表达。此外,褪黑素还抑制了LPS诱导BV2细胞活化过程中CD147、MMP-3、MMP-8的mRNA和蛋白表达变化,提示褪黑素可能通过对CD147/MMPs的作用而影响LPS诱导的小胶质细胞活化。进一步研究发现,褪黑素抑制了LPS诱导的BV2细胞MAPK和NF-κB通路的激活,而MAPK/NF-κB是CD147表达以及小胶质细胞活化关键的上游信号通路;当抑制MAPK通路后,LPS诱导的CD147表达显著下降,提示褪黑素可能通过MAPK通路参与调节CD147/MMPs在LPS诱导的小胶质细胞活化中的作用。研究结论:通过体外实验,初步证实CD147可能在LPS诱导的小胶质细胞活化中发挥一定的作用,CD147对LPS诱导的小胶质细胞活化的调节可能通过其对MMPs的调节而实现。此外,褪黑素可能通过CD147发挥其对LPS诱导的小胶质细胞炎性活化的抑制效应。