早在一个多世纪前德国病理学家Schmorl在死于子痫孕妇的肺毛细血管中发现胎儿细胞，首次认识到病理条件下胎儿母体细胞间的交通。1969年Walknowska等报道正常妊娠时胎儿细胞进入母体血循环并提出这类细胞可用作染色体分析。此后相继有学者观察到母体血循环中带有Y染色体的孕妇怀有男性胎儿，提示人们可以利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行产前诊断。只是缺少能够分离出母体外周血中胎儿细胞的方法和较灵敏的检测技术，故分析母血中的胎儿细胞成效不大。 已发现有4类胎儿细胞可进入母体血循环：有核红细胞，滋养细胞，淋巴细胞和粒细胞。滋养细胞与子宫的关系最紧密。当它们侵入子宫内膜时，很可能有若干滋养细胞进入母体血循环。由于其独特的形态，并且分泌绒毛膜促性腺激素以表达hCG-mRNA为标志，而能明确地被检测到，可能是理想的用于诊断分析的存在于母体血循环中的胎儿细胞。正常情况下，10ml母体外周血中大约有10-1000个滋养细胞。重度妊高征、非整倍体妊娠、多胎妊娠等情况时外周血中可检测到的滋养细胞增加。面对如此稀少的胎儿细胞，不仅需要有效的方法从母血中分离富集这些 一 细胞，也需要有一个灵敏的方法检测、判断细胞数显的多少。 近年，随着分子生物学技术的进展，在外周血中检测非血细胞 或肿瘤细胞的技术得以迅涩发展。在孕妇外周循环血中分离检测 胎儿细胞是当前研究的热点之一。一些研究旨在探讨从母体循环 血中获取胎儿细胞从而获取足够的迪传信息，用于围产湖胎儿先天 异常的诊断。 本研究试阳以胎儿滋养绷胞或J A R 绷胞作为分选日标，汕过 荧光定凰PCR；建立灵敏可靠的在外周血中检测胎儿滋养细胞或 肿渊细胞的方法。为选择在母血中获取胎儿绷胞的最伴孕助；探讨 妊秆门正的刑囚；滋芥抑胞川。仰转移的’卜川］诊断典定方法学基训1。 本课题设计在 10ml正常人外周血中掺入已知的不同数量的滋养细 胞或JAR绷胞，建立外周血中检测胎儿滋养绷胞或肿椭纫胞的实验榄型。 行红细胞裂解或密度梯度离心富集后提取总RNA，逆转录成CDNA。以 只－卜＊G从贝设计的引物及士坎什作贝光垃凰＊CR，以小卜o浓甩的已剁绷胞 作椭坐标，以通过计算机测得的炎光量（循环闽值）作纵坐标，进行滋养 细胞或JAR细胞定量。 结仪发现滋养绷胞／JAR绷胞数挝的多少与捉取的RNA的多少 直接影响FQ－＊＊－pCR的检出水平，呈正相关。从！0’个滋养细胞八AR 纠】胞捉取的mRNA在FQ－PCR时，只需13／16个循环（循环闽值） 即可检测到探针荧光释放所形成的典型的S 型曲线的起始部，当 滋养绷胞／JAR细胞的数旦巡M或mRNA frttll当于10’、10‘、10’、 10＼10‘、10‘细胞时，检测到探针荧光释放所貌的循环数递增， 分别达到！3、！6、！7、Zt、24、26个循环，呈良好的线性关系（JAR 细胞为 16、18、ZI、2 5、2 6、2 9个循环X 其灵敏度可达到检测相 当于 1个滋养细胞／JAR表达的e，hCG mRNA的揖，循环闽值与细 胞数的对数呈何线州关（R—O．99，n－6。P＜0．01） 小卜。1数欣的滋芥刎胞炒入外川血人二，儿经红刎胞裂灿W地1队 RNA作 FQ－PCR者：当细胞数为10个／10ml时，荧光定显 PCR测 2 2001年浙江大学硕士学位论文得的 8－hCG mRNA 结果不稳定，而当细胞数＞102／1 oml 时方可稳定地测得的p小CG mRNA，可见到典型的荧光释放 S型曲线。滋养细胞掺入外周血后，先n山 离心后，再做荧光定量PCR，则要在细胞数 ＞10’时方可满意地检测到，而细胞数 ＜10’时结果不稳 J定。 JAR 细胞掺入外周血后再行 fi－hCG mRNA 检测的效率降低。10’＊ 个JAR细胞掺入 10ml外周血中混匀，经红细胞裂”解后抽提总 RNA做 FQ－RT－PCR测定 6－hCG mRNA，发现细胞数＜102／10ml时所测结果不稳定或测不出；当细胞数Z1炉八oml 时方可检测到。不同细胞数的FQPCR iN环闽值与未掺入母川L的对等数凰的滋养细胞／JAR绷胞接近。 以上结果表明本研究荧光定量PCR所采用的引物探针及PCR运作积）于能够刃敏地检测6－hCG－mRNA，具有很好的B－hCG－mRNA特异性?