论文部分内容阅读
研究背景：肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视,现已成为当今肿瘤研究的一个热门话题。结肠癌是世界常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率位居欧美发达国家的第三位。近年来,由于环境的恶化和饮食结构的调整,我国结肠癌的发病率和死亡率逐年上升,严重危害了人民的生命和健康。从肿瘤微环境的角度出发,对比研究肿瘤间质细胞与正常组织间质细胞的差别,将有助于发现肿瘤微环境所独有的特征,为寻找诊断标志物以及为开展间质靶向治疗打下坚实的基础。本研究采用激光捕获显微切割(laser capturemicrodissection,LCM)技术从结肠癌组织与正常结肠黏膜组织中纯化肿瘤间质和正常间质,应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术和二维液相色谱串联质谱(2D LC-MS/MS)比较结肠癌间质和正常结肠黏膜间质蛋白质表达谱的差异,从蛋白质水平探讨肿瘤间质在肿瘤发生发展中的作用。第一章LCM结合iTRAQ标记定量蛋白组学筛选结肠癌间质相关蛋白质目的：筛查结肠癌间质和正常结肠粘膜间质差异表达蛋白质,对筛查出的差异表达蛋白质进行生物信息学分析。方法：①采用LCM技术纯化12对结肠癌间质及配对正常结肠黏膜间质；②iTRAQ-118和iTRAQ-121分别标记结肠癌间质及配对正常结肠黏膜间质多肽混合物后,2D LC-MS/MS鉴定结肠癌间质及配对正常结肠黏膜间质差异表达蛋白质；③采用David Functional Annotation对差异表达蛋白质进行细胞成分、生物学途径和分子功能分析。④Ingenuity Pathway Analysis(IPA)对差异表达蛋白质进研究这些差异表达蛋白质之间的相互关系及相关的信号通路。结果：①成功纯化结肠癌间质及正常结肠黏膜间质；②鉴定了70个差异表达蛋白,其中37个蛋白在结肠癌间质中高表达,33个蛋白在结肠癌间质中表达降低；③根据David功能分析软件对70个差异表达蛋白质进行分析。按照细胞成分注释,这些差异表达蛋白质中的大多数属于细胞外基质蛋白(37.5%)、细胞器蛋白(28.6%)和细胞骨架蛋白(25%)。按照生物学功能分类,参与细胞外基质的占37.5%,其次为内质网应激和细胞骨架,而参与代谢、炎症反应等蛋白所占比例相对较少。按照分子功能注释,可以看出,91.8%的差异蛋白属于binding蛋白。参与酶调节活性的蛋白占仅1%。④IPA软件对70个差异表达蛋白质的分析结果：发现了51个经典通路、建立了4个确信度高的通路网络、筛选出56个网络相关蛋白质。经典通路分析显示了与肿瘤相关的信号通路,包括肌动蛋白细胞骨架信号、ILK信号通路、14-3-3介导的信号通路、血管内皮生长因子信号通路、Wnt/β-catenin信号通路等。生物学功能分析所示,差异表达蛋白质相关的疾病中排在首位的是“肿瘤”,此外,与肿瘤发展相关的生物学功能是：炎性疾病、免疫性疾病、代谢疾病、细胞死亡、细胞生长和增殖等。4个确信度高的通路网络分别是：炎性与免疫调控网络、发育障碍与遗传性疾病网络、消化系统发育和功能网络、炎性调控以及结缔组织疾病网络。⑤依据David和IPA对70个差异表达蛋白质与肿瘤相关的生物学功能分析结果,从炎症反应、细胞外基质、代谢、内质网应激、细胞骨架和蛋白质聚合6个方面对差异表达蛋白质进行了功能分类。并将其绘制成图,图中清晰的呈现差异表达蛋白质与肿瘤相关生物学功能的关系。其中,DCN、FN1、 PKM2、HSP90B1、S100A9、MYH9、TUBB和YWHAZ这8个差异蛋白质不仅参与一种生物功能,它们同时参与两种甚至三种生物功能的调节,从多种途径参与肿瘤的发生发展；并且还分别位于4个通路网络的核心位置,在网络中具有关键作用。结论：①首次采用iTRAQ标记定量蛋白质组学和LCM结合的方法鉴定及筛选结肠癌间质差异表达蛋白质；②GO功能分析和IPA通路分析显示了差异表达蛋白质的细胞成分、分子功能、生物学功能、信号通路以及通路网络,为揭示结肠癌发生发展的分子机制和寻找药物干预靶点提供了线索。第二章间质差异蛋白质表达验证及结肠癌诊断标志物筛选目的：验证差异蛋白质DCN, FN1, PKM2, HSP90B1, S100A9, MYH9,TUBB和YWHAZ的表达情况,寻找能用于结肠癌诊断的标志物。方法：①采用Western blotting对部分差异表达蛋白质(DCN,FN1, PKM2, HSP90B1, S100A9, MYH9, TUBB和YWHAZ)进行验证；②采用免疫组化的方法检测在肿瘤发生发展过程中有重要作用的4个蛋白质：DCN, FN1, PKM2和HSP90B1,检测这4个蛋白质在结肠癌及正常结肠黏膜组织中的表达情况；③应用ROC曲线分析DCN,FN1, PKM2和HSP90B1单独或联合使用判别结肠癌的能力。结果：①Western blotting结果显示：DCN、PKM2、HSP90B1在结肠癌间质中表达下调,FN1、S100A9、TUBB、MYH9、YWHAZ在结肠癌间质中表达上调；②免疫组化结果：DCN、PKM2和HSP90B1在结肠癌间质中表达下调,FN1在结肠癌间质中表达上调；③ROC曲线结果提示：4个蛋白质单独判别结肠癌的敏感性和特异性分别为70-78%和70-87%,4个蛋白质组合判别结肠癌的敏感性和特异性均达到82.6%和82.6%；4个蛋白质中,选用3个为一组进行组合判别结肠癌的敏感性和特异性分别为65.2%-82.6%和82.6%-87%；4个蛋白质中,采用2个为一组进行组合判别结肠癌的敏感性和特异性分别为69.6%-82.6%和65.2%-87%。DCN、FN1、PKM2和HSP90B1四者联合与DCN、FN1和HSP90B1组三者联用的敏感性、特异性相同。三者联合检测中与PKM2联合的组合与两两联合检测时的敏感性和特异性变化不大,显示在联合检测应用中PKM2的意义不明显。结论：①Western blotting和免疫组化结果与蛋白质组结果一致。证实了iTRAQ标记定量蛋白质组学方法筛选到的间质差异表达蛋白质准确可靠。②DCN、FN1和HSP90B1多指标联合检测比单指标检测提高了判别结肠癌的敏感性和特异性,为筛查结肠癌诊断的新的分子靶标提供了实验依据及新的靶标。