鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方常见的恶性肿瘤，临床上有一半以上的鼻咽癌患者确诊时已出现了颈部淋巴结转移及远处转移。晚期鼻咽癌患者主要出现肝转移和骨转移，这是导致患者死亡的主要原因。尸检资料显示相当多的鼻咽癌患者死于肝转移。因此阐明鼻咽癌肝转移的分子机制，筛查鼻咽癌肝转移相关基因，从而对鼻咽癌肝转移进行干预，这将对临床治疗有重要的意义。 肿瘤转移的发生是宿主与恶性肿瘤细胞相互作用的结果，是个高选择的过程，只有具有转移潜能的细胞亚群才能发生转移，并且转移的肿瘤细胞具有一定的组织倾向性。因此分离并鉴定出具有不同转移方向的肿瘤细胞亚克隆，有针对性的比较同一亲本来源、不同转移潜能的细胞系，寻找与转移相关的正性或负性调控因素，对于早期预测和诊断肿瘤转移有重要意义。 本实验前期通过利用鼻咽癌细胞株5-8F-EGFP裸鼠脾脏接种法体内筛选得到肝转移细胞亚系5-8F-H3，并利用前期芯片筛选出第3代细胞中表达差异2倍以上的基因281个。其中81个基因在肝转移亚群中表达上调，200个基因表达下调。通过对81个表达上调基因进行文献调研并结合MILANO软件，发现SLUG、TNFAIP3、CXCR4等基因与肿瘤的转移密切相关。 SLUG为Snail家族锌指蛋白转录因子，能抑制内源性E钙粘蛋白的表达，引发EMT，且为头颈部癌淋巴转移的标签基因，可以作为恶性肿瘤播散的标志。研究表明，该基因与能够促进乳腺癌、大肠癌、肺腺癌、卵巢癌、食管癌等多种肿瘤的侵袭和转移。Roberta等研究发现利用RMAi下调SLUG可以导致神经母细胞瘤的侵袭和转移能力下降。 TNFAIP3为肿瘤坏死因子诱导蛋白，是一种锌指结构蛋白，通过抑制细胞凋亡，参与肿瘤的恶性进展过程。研究表明，该基因在头颈部癌淋巴结转移中高表达，并且为头颈部癌淋巴转移的标签基因。 Tet-on基因表达调控系统是MGossen等通过对其之前建立的Ten-off系统进行改进，改变Tet上的四个氨基酸，在5’端接上一个核定位信号，构建成反义四环素激活子rtTA，从而建立了Tet-on调控系统。Tet-on调控系统包括调节质粒和反应质粒，调节质粒包含一个四环素调控的反式激活子rtTA，反应质粒含有目的基因，并受四环素反应元件TRE的操纵，TRE含有操纵基因TetO的42个碱基的7次正向重复序列，它的上下游各有一个CMV的最低限度启动子PminiCMV，当DOX存在时，rtTA可与TetO结合启动上下游基因的转录。Tet-on系统特异性强，具有严密的开关调控，在无诱导时，目的基因背景表达低甚至不表达，因此Tet-on系统在生命科学领域应用更为方便。 本课题的研究目的是筛选与肝转移相关的基因并进行初步的验证，为深入研究鼻咽癌肝转移的分子机制及鼻咽癌肝转移的早期诊断和治疗提供理论依据。 本课题进行了如下研究： （一）鼻咽癌肝转移相关基因筛选。 本实验利用MILANO软件对前期芯片数据81个肝转移细胞亚系表达上调基因进行肿瘤转移相关性分析，并结合文献调研，发现SLUG、TNFAIP3、CXCR4等基因与肿瘤的转移密切相关。因此本文通过real-timePCR方法进行验证，比较5-8F及5-8F-H3中各基因的表达情况。结果显示：在5-8F-H3中SLUG、TNFAIP3、CTGF、PTGS2、CXCR4mRNA的表达分别是5-8F的11．23倍、20．80倍、7．27倍、35．97倍、3．71倍，差异具有统计学意义（P<0．05）。通过进一步文献调研发现：TNFAIP3、SLUG均为头颈部癌淋巴转移的标签基因。因此，本研究选取TNFAIP3、SLUG为研究对象，采用RNAi，以期确定TNFAIP3、SLUG在鼻咽癌肝转移过程中的作用。 （二）TNFAIP3基因沉默对鼻咽癌细胞肝转移生物学特性的影响。 采用Tet-on调控系统，构建了针对靶基因TNFAIP3的RNAi重组载体pSUPERIOR-T。应用酶切鉴定和序列分析方法验证后，利用脂质体转染技术将pSUPERIOR-T及Tet-on载体导入5-8F-H3细胞，嘌呤霉素（Puromycin）筛选获得抗性克隆，PCR证实外源DNA已整合到细胞基因组DNA中，荧光定量RT-PCR结果表明，pSUPERIOR-T表达载体经DOX（Doxycycline）诱导24小时后能特异性的引起靶基因TNFAIP3的表达下调，干扰效率可达到95％，进一步，WesternBlotting分析表明整合TNFAIP3-shRNA的细胞经DOX诱导后蛋白表达下调达到84％，表明已成功地建立稳定转染TNFAIP3-shRNA的5-8F-H3细胞系5-8F-H3/TNFAIP3-shRNA。 采用MTT法检测TNFAIP3下调后细胞的体外增殖情况，结果显示，与5-8F-H3、5-8F-H3/D+及5-8F-H3/TNFAIP3-shRNA细胞诱导前比较，5-8F-H3/TNFAIP3-shRNA细胞经DOX诱导后细胞增殖速度减慢，并且呈时间依赖关系（F=12．470，P<0．001）。平板克隆形成试验显示5-8F-H3/TNFAIP3-shRNA细胞经DOX诱导后细胞活力显著下降（F=35．719，P<0．001）。利用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期，结果显示5-8F-H3/TNFAIP3-shRNA经DOX诱导后S期比例减少，表明TNFAIP3表达沉默后细胞增殖缓慢。综上结果表明TNFAIP3表达下调后，鼻咽癌细胞体外生长被显著抑制。 体外侵袭小室检测TNFAIP3基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变，结果显示，与5-8F-H3、5-8F-H3/D+及5．8F-H3/TNFAIP3-shRNA细胞诱导前比较，5-8F-H3/TNFAIP3-shRNA细胞经DOX诱导TNFAIP3基因表达沉默后，细胞侵袭能力显著降低（F=26．157，P<0．001），说明TNFAIP3表达沉默抑制了鼻咽癌细胞的体外侵袭能力。 通过皮下成瘤实验观察TNFAIP3基因表达沉默后对鼻咽癌细胞体内增殖能力的影响。结果显示经DOX诱导TNFAIP3基因表达沉默后，显著抑制了鼻咽癌细胞体内增殖能力。进一步通过脾脏接种法，观察TNFAIP3基因表达沉默后对细胞体内侵袭、转移能力的影响。结果显示生理盐水注射组100％的裸鼠形成肝转移，而在DOX诱导组70％的裸鼠形成肝转移，但转移灶的数量和重量都小于生理盐水注射组。 （三）SLUG基因沉默对鼻咽癌细胞肝转移生物学特性的影响。 采用Tet-on调控系统，构建了针对靶基因SLUG的RNAi重组载体pSUPERIOR-S。试验方法同第二部分。pSUPERIOR-S及Tet-on载体导入5-8F-H3细胞，嘌呤霉素筛选获得抗性克隆，PCR证实外源DNA已整合到细胞基因组DNA中，荧光定量RT-PCR结果表明，pSUPERIOR-S表达载体经DOX诱导24小时后能特异性的引起靶基因SLUG的表达下调，干扰效率可达到84％，进一步，Western Blotting分析表明整合SLUG-shRNA的细胞经DOX诱导后SLUG蛋白表达下调达73％，表明已成功地建立稳定转染SLUG-shRNA的5-8F-H3细胞系5-8F-H3/SLUG-shRNA。 采用MTT法检测SLUG下调后细胞的体外增殖情况，结果显示，与5-8F-H3、5-8F-H3/D+及5-8F-H3/SLUG-shRNA细胞诱导前比较，5-8F-H3/SLUG-shRNA细胞经DOX诱导后细胞增殖速度减慢，并且呈时间依赖关系（F=9．852，P<0．001）。平板克隆形成试验显示5-8F-H3/SLUG-shRNA细胞经DOX诱导后细胞活力显著下降（F=21．797，P<0．001）。利用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期，结果显示5-8F-H3/SLUG-shRNA经DOX诱导后S期比例减少，表明SLUG表达沉默后细胞增殖缓慢。综上结果表明SLUG表达下调后，鼻咽癌细胞体外生长被显著抑制。 体外侵袭小室检测SLUG基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变，结果显示，与5-8F-H3、5-8F-H3/D+及5-8F-H3/SLUG-shRNA细胞诱导前比较，5-8F-H3/SLUG-shRNA细胞经DOX诱导SLUG基因表达沉默后，细胞侵袭能力明显降低（F=44．681，P<0．001），说明SLUG表达沉默抑制了鼻咽癌细胞的体外侵袭能力。 通过皮下成瘤实验观察SLUG基因表达沉默后对鼻咽癌细胞体内增殖能力的影响。结果显示经DOX诱导后，显著抑制了鼻咽癌细胞体内增殖能力。进一步通过脾脏接种法，观察SLUG基因表达沉默后对细胞体内侵袭、转移能力的影响。结果显示生理盐水注射组100％的裸鼠形成肝转移，而在DOX诱导组60％的裸鼠形成肝转移，但转移灶的数量和重量都小于生理盐水注射组。 结论： 1、筛选出TNFAIP3、SLUG、CTGF等可能与鼻咽癌肝转移相关的基因。 2、TNFAIP3、SLUG基因表达沉默后显著抑制了鼻咽癌细胞体内外增殖、侵袭及转移能力。 3、TNFAIP3、SLUG可能与鼻咽癌肝转移密切相关，可能是促进鼻咽癌肝转移的重要基因。