研究目的生物材料属天然细胞外基质(ECM)，经过机械法、化学法、酶学法等方法，除去原组织中的DNA及细胞，再通过交联、消毒等处理后制备而成，具有一定的机械强度，且低免疫原性。以P-SIS为例，其结构绝大多数为I型和III型胶原纤维，含量超过90%。P-SIS在保留一定机械强度的条件下，还包含多种细胞因子，如基本成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growthfactor,bFGF)、转化生长因子（Transforminggrowth factor,TGF）、表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF)、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growthfactor-1,IGF-1)以及葡糖氨基聚糖类、纤连蛋白类、软骨素、透明质酸，这些成分对组织重塑和伤口愈合起重要作用[1-2]。P-SIS已经广泛应用于现代生物医学领域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬脑膜修补、血管重建、修复部分或全层皮肤损伤[3-5]。生物材料除了拥有与合成材料一样的疝修补低复发率，同时在生物相容性、抗粘连性等方面也较人工合成材料更为理想，术后疝复发、腹腔感染，肠梗阻、瘘形成等不良反应的发生率明显较低[6]。细胞外基质虽有以上所述的种种优点，但对于某一种ECM的制备方法却没有统一标准；由于各种ECM结构差异较大，应用相同脱细胞方法较难达到理想结果。目前常用的脱细胞方法主要分为三大类：物理方法、化学方法和消化酶学方法。如果应用的试剂剂量过小，可使细胞成分残留较多，植入机体后易引起机体免疫排斥反应，局部组织粘连严重、组织包裹钙化等；若应用大剂量试剂，能将细胞除去干净，又同时会对ECM本身结构造成损伤[7]。因此，如何较彻底清除ECM中的细胞和DNA成分，并尽可能减少对ECM组织结构的破坏，保持其原有的生物活性、力学特性，是当今脱细胞处理方法的研究热点。本实验小组拟在以上研究基础上，系统比较三种不同方法制备猪小肠粘膜下层（P-SIS）的体外单轴力学抗拉力、DNA浓度测定、生长因子含量的测定、及切片染色等结果，并用三种不同方法制备的P-SIS对大鼠腹壁部分缺损进行修复，观察修复后区域抗张力、修复后局部及全身的免疫原性等情况，明确三种不同方法制备P-SIS的差异，为寻找优良的制备方法提供依据。综合分析三种不同方法制备P-SIS修复后大鼠腹壁缺损效果，为选择良好的制备方法提供实验依据。研究方法三种方法制备猪小肠黏膜下层：取4h内市售新鲜猪空肠，分别采用机械法脱细胞、酸碱法脱细胞、SDS法脱细胞，制备P-SIS生物补片。每步操作后留取样品（n=10），分别作为A、B、C组；以新鲜猪空肠作为对照。动物体外测试：①将三种方法制备好的材料分别进行材料单轴力学测试（由上海同济大学医学院生物力学测试实验室协助完成），②采用HE染色、Masson染色、天狼猩红染色、PAS染色（由上海长征医院病理科协助完成）、DNA凝胶电泳等实验方法明确不同方法制备P-SIS的细胞或DNA含量；③采用Elisa方法检测生长因子VEGF、TGFβ1的残余量。动物体内测试和评估：分别用三种不同方法制备的P-SIS修补大鼠腹壁部分缺损模型，通过腹腔注水实验、修补区域免疫组化测定炎性细胞、Ellisa方法测定炎性介质等方法，评价其各组术后抗张力及免疫炎症反应。研究结果1、动物体外测试：通过单轴力学拉伸实验结果分析，酸碱组制备的P-SIS拉伸强度、最大伸长率优于SDS组和机械组（P<0.05）；通过各种染色、及DNA浓度测定可以得出，酸碱组DNA含量明显低于其他两组（P<0.05），且酸碱组弹性纤维结构排列整齐，而SDS组弹性纤维结构松散、部分纤维已出现断裂；通过Ellisa方法测定生长因子TGF-β、VEGF含量得出，酸碱组生长因子含量较SDS组高（P<0.05）。2、动物体内测试和评估：术后36只SD大鼠均存活，无明显感染、血肿及腹壁疝形成等情况，腹壁部分缺损修复完整。通过对三组术后8周大鼠进行腹腔注水试验，均未见修补区域膨出、腹壁疝形成（P>0.05）；通过Ellisa方法测定血清中IL-6、TNF-α含量的结果得出，酸碱法制备的P-SIS植入动物体内后，IL-6、TNF-α含量均较SDS组和机械组低（P<0.05）；通过免疫组化检测局部修复区炎性细胞含、内皮增生细胞含量，得出结论，酸碱组结果总体优于SDS组和机械组（P<0.05）。结论在三种不同方法制备的P-SIS中，酸碱法制备的P-SIS在力学特性、生长因子含量、残余DNA浓度测定方面均优于机械法和SDS法制备的P-SIS。植入机体后，酸碱组抗张力无明显降低，且在引起机体免疫反应、内皮增生细胞含量测定方面，酸碱组优于其他两组，综上所述，本实验认为酸碱法在三种方法中最优。