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多巴胺（dopamine, DA）作为一种广泛存在人类和动物脑中重要的神经递质,参与机体的运动及神经内分泌的调节,并与多种神经系统疾病发生有关。多巴胺能神经元可摄取血液中的L-酪氨酸,后者在胞浆内被酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）催化生成L-多巴（L-dihydroxy phenylalanine, L-dopa）,再经多巴脱羧酶（dopa decarboxylase, DDC）作用生成多巴胺。拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina Roger）是一种典型的社会性昆虫,隶属于膜翅目（Hymenoptera）,蚁科（Formicidae）,多刺蚁属（Polyrhachis）。拟黑多刺蚁具有明确的社会性特征,如独特的品级分化、复杂的行为活动、分工明确等；是研究昆虫发育、行为调控机制等方面重要的资源昆虫。本实验以拟黑多刺蚁为研究对象,采用RT-PCR及RACE技术从拟黑多刺蚁体内克隆获得TH和DDC的全长cDNA序列；并对其核苷酸序列和蛋白序列进行生物信息学分析；通过实时定量RT-PCR技术对拟黑多刺蚁不同品级脑部、不同品级全身、不同发育阶段虫体、Y迷宫学习记忆训练前后工蚁脑部TH和DDCmRNA表达水平进行相对定量研究；利用原位杂交技术对不同品级脑部、行为训练前后工蚁脑部TH和DDC mRNA表达水平进行定位研究。研究结果如下：1.拟黑多刺蚁TH cDNA序列全长2429bp,包含一个长度为1713bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码570个氨基酸残基,编码的蛋白质分子量为65.09kDa,等电点pI=5.26,5’端非编码区（5’-UTR）长度为357bp,3’-UTR为359bp。同源分析表明该蛋白与金小蜂、意大利蜜蜂、赤拟谷盗、家蚕等相似度都在70%左右,甚至与鱼类、哺乳类包括大鼠和人类在蛋白质序列上都有50%以上的相似性。运用生物信息学分析,TH蛋白一级氨基酸序列包含的许多功能基序信息以及CD（conserved domain）保守区预测的功能区与其他物种THs蛋白序列都是高度保守的。因此,可以确定本实验克隆所得序列为拟黑多刺蚁TH全长cDNA序列,命名为PvTH并上传至GenBank,获得序列号AEC14314。2.采用荧光实时定量RT-PCR方法对拟黑多刺蚁不同发育阶段、不同品级蚂蚁全身、不同品级蚂蚁脑部及Y迷宫训练前后工蚁脑部PvTH mRNA进行相对定量研究。结果表明,PvTH在各个时期和各个品级中均有表达。对拟黑多刺蚁发育阶段研究表明,PvTH在蛹期表达量最高,四龄幼虫期最低。在成虫阶段,工蚁表达量最高,雌蚁最少,且表达量具有显著的差异。在三个品级蚂蚁脑部的比较中,工蚁表达量最低,雄蚁和雌蚁表达量都较高。这种表达的差异性可能与TH在不同发育阶段及不同品级蚂蚁机体所发挥的作用有关。对Y迷宫训练前后工蚁脑部的表达量进行比较发现训练后工蚁脑部TH的表达量较未训练的高。这种表达的差异性可能与蚂蚁的学习行为有关。3.对拟黑多刺蚁不同品级脑部PvTH mRNA采用地高辛标记特异性寡核苷酸探针原位杂交技术进行定位研究,结果发现在视叶、嗅叶及Keyron细胞等部位都有较强的阳性反应。雄蚁的视叶的阳性反应最强,雌蚁、雄蚁中央复合体阳性反应较强。工蚁嗅球和蕈形体表达水平相对较高。TH在不同品级蚂蚁脑部表达的差异性反映了TH可能在不同品级蚂蚁社会分工中发挥的作用不同有关。Y迷宫训练后,工蚁脑部视叶、嗅叶及中央复合体与未训练的工蚁脑部相比,均有较强的阳性表达。推测通过学习训练可能促进TH的量增加,而TH可能与蚂蚁的学习记忆有关。4.拟黑多刺蚁DDC cDNA序列全长1893bp,包含1443bp的开放阅读框,编码480个氨基酸残基,编码蛋白质的分子量为54.60kDa,等电点pi=6.38,5’UTR71bp,3’UTR379bp。同源分析表明该蛋白与意大利蜜蜂、金小蜂、赤拟谷盗等有75%左右的相似性。DDC蛋白一级氨基酸序列包含的许多功能基序信息及CD保守区预测的功能区与其他物种DDCs蛋白序列高度保守。因此确定本实验克隆所得序列为拟黑多刺蚁DDC全长cDNA序列,命名为PvDDC。上传至GenBank,获得序列号JN979785。5.采用荧光实时定量RT-PCR方法对拟黑多刺蚁不同发育阶段,不同品级蚂蚁全身,不同品级脑部及Y迷宫训练前后工蚁脑部PvDDmRNA进行相对定量研究。结果表明,PvDDC在拟黑多刺蚁各时期和品级中均有表达。在发育阶段相对实时定量的研究中发现,蛹期表达量最高,卵最低。对成虫阶段PvDDC的定量分析发现,雄蚁表达量最高,工蚁较雄蚁低,雌蚁最少。推测其与不同品级和阶段虫体所需的DDC的量的差异性有关。三个品级脑部研究发现雄蚁和雌蚁表达量较高,工蚁最低。Y迷宫训练后工蚁脑部的表达量高于未训练的工蚁。推测DDC可能参与了蚂蚁的学习记忆。6.采用原位杂交技术对拟黑多刺蚁不同品级脑部DDC mRNA定位研究,结果表明DDC在拟黑多刺蚁脑部表达广泛,蕈形体、视叶和中央复合体中都有阳性反应。雄蚁视叶具有较高水平表达。工蚁嗅球内有相对较强的阳性反应。Y迷宫训练后定位研究表明,训练后工蚁脑部的DDC在蕈体冠、蕈体柄、视叶都有较未训练的工蚁较强的阳性反应。这可能与不同品级拟黑多刺蚁的行为有关,由此推测DDC可能参与了拟黑多刺蚁的学习记忆。本研究首次克隆获得膜翅目昆虫拟黑多刺蚁TH和DDC的全长cDNA序列,并上传GenBank;相对实时定量结果表明,PvTH和PvDDc mRNA在拟黑多刺蚁个体不同发育阶段及成虫脑部具有表达,说明这两个基因的表达产物与昆虫的发育和学习行为相关。原位杂交技术研究发现这两个基因的mRNA在三个品级脑部有差异性表达,进一步证实其与昆虫学习行为、神经和机体发育的相关性。这些结果将为深入探讨昆虫TH和DDC的具体功能奠定基础。