【摘 要】
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具有特殊性状的水稻突变体对水稻新品种选育以及新的功能基因发现具有重要的应用和理论研究价值。本研究室利用改良的“花粉管介导法”将外源的玉米基因组DNA片段直接导入受
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具有特殊性状的水稻突变体对水稻新品种选育以及新的功能基因发现具有重要的应用和理论研究价值。本研究室利用改良的“花粉管介导法”将外源的玉米基因组DNA片段直接导入受体水稻“日本晴”中,获得了丰富的变异材料。本文选取具有特殊变异性状且来源于同一受体的18种分离材料,利用AFLP分子标记技术对其基因组DNA的多态性进行分析,并对扩增得到的特异条带进行回收测序,分析产生变异性状的原因,寻找碱基突变发生的内在规律,为外源基因组DNA诱导的生物诱变技术提供理论依据,为新的功能基因发现提供理论数据。首先,对64对AFLP选扩引物进行筛选,选出了扩增条带数量合适、多态性较好的引物共27对。然后利用筛选出的引物组合对18种水稻姊妹系进行扩增,共得到97条特异,其中新带31条,缺失带66条。表明外源DNA片段的导入可引起受体的DNA多态性发生改变。对所得到的特异序列进行回收克隆测序,并将测序结果与对照及数据库中“日本晴”序列进行比对,统计碱基突变情况。结果如下:1、31条新带测序共得到碱基数目为8692个,其中发生突变的碱基有155个,总突变率为1.78%,显著高于自发突变的概率(小于0.1%),表明外源玉米DNA导入对受体具有显著的诱变效应。2、新带产生的原因主要有酶切识别序列的碱基突变、选择性碱基突变,以及DNA片段的插入或(和)缺失。3、在31条新带的碱基突变类型中,发生碱基置换的频率(55.97%)>碱基缺失(28.30%)>碱基插入(15.72%),说明外源玉米基因组DNA可以诱导水稻基因组发生突变,且碱基置换发生频率最高,碱基插入发生频率最低。4、在碱基置换中,碱基转换发生的概率(71.59%)显著高于碱基颠换(28.41%)。5、在碱基置换类型中,单碱基置换频次为90.00%。其中转换频次64.45%,颠换频次23.23%,缺失频次7.07%,插入频次5.05%,存在典型的“转换偏差”现象。6、在31条新带中,有6条新带的氨基酸编码序列发生了突变,其中有4条序列(P1M1-V14-131,P7M7-V10-227,P7M7-V3-197,P8M1-V5-216)发生非同义突变,所编码的氨基酸序列发生了改变。氨基酸的改变引起了蛋白质的理化性质、结构域、磷酸化位点以及亚细胞定位在内的多种变化。说明外源DNA导入可引起受体基因表达产物发生变化,进而导致突变体性状变异。7、在66条缺失带中,有29条完全位于基因编码区、6条有部分序列位于基因编码区,说明这部分条带所在基因发生了碱基突变,可能引起基因编码蛋白质的序列、结构和功能发生变化,从而引起性状变异。总之,外源基因组DNA导入可以诱导受体基因组发生碱基的置换、插入和缺失,说明外源DNA诱导的生物诱变技术是一种有效的诱变手段。受体基因组的碱基突变导致了大量变异材料的产生。这些突变体为水稻育种提供了丰富的种质资源;也是发现新的功能基因及理论研究的很好材料。
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