论文部分内容阅读
鸭疫里默氏杆菌是养鸭业的主要病原菌之一,属于革兰氏阴性菌。鸭疫里默氏杆菌对多种抗生素有天然耐受,并易对敏感性抗生素产生耐药性。此外,疫苗对鸭疫里默氏杆菌没有交叉保护。所以用抗生素药物和疫苗很难防控鸭疫里默氏杆菌。研究表明,从营养免疫的角度去防控病原菌可能是一种新的有效的途径。铁离子和血红素等重要的营养物质是鸭疫里默氏杆菌所必需的,而鸭疫里默氏杆菌的铁离子和血红素的摄取机制的相关研究还相当匮乏。所以我们拟从血红素和铁离子转运的关键蛋白TonB入手进行相关的机制研究。我们的研究结果如下：1. tonB基因的分析对鸭疫里默氏杆菌R. anatipestifer ATCC 11845株(RA ATCC)全基因组进行分析发现在基因组不同的位置存在3个tonB基因,分别为tonB1, tonB2和tonB3。其中,tonB1与exbB1-exbD1在一个操纵子内,tonB2与exbB2-exbD21-exbD22在一个操纵子内,而tonB3则单独存在。在序列上,TonB1和TonB2蛋白的序列同一性大约为10%,TonB1和TonB3蛋白的序列同一性大约为10.65%,TonB2和TonB3蛋白的序列同一性大约为34.71%。3个TonB蛋白均没有保守的“YP”和“SSG”基序。2. TonB蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备首先把RA ATCC基因组上的3个tonB基因用分子克隆的方法克隆到表达载体pBAD24中；再将重组的表达质粒转化到表达菌JP313进行原核表达；用亲和层析的方法纯化带His-tag的重组TonB蛋白；最后用纯化的蛋白免疫昆明鼠,3次免疫后采集血液,收集血清,获得针对鸭疫里默氏杆菌TonB蛋白的鼠源多克隆抗体。3. tonB基因缺失株的构建将tonB1基因的上游同源臂,红霉素抗性基因盒,下游同源臂用融合PCR的方法融合;将tonB2基因的上游同源臂,壮观霉素抗性基因盒,下游同源臂用酶切-连接-PCR的方法融合。将重组的片段克隆到自杀质粒pEX18Gm中,再将重组的自杀质粒转化到大肠杆菌S17-1中；用接合转移的方法将S17-1中的自杀质粒转入RA ATCC中并用对应的抗生素进行筛选。最后获得了RA ATCC AtonB1::ermR和RA ATCC △tonB2::spcR。在tonB2基因缺失株的基础上缺失tonBl基因既获得了双缺失株RA ATCC AtonBl::ermR AtonB2::spcR。随后,我们运用Western-Blot方法在蛋白质水平对这些基因缺失株进行了鉴定,运用RT-PCR的方法证明了这些基因缺失株没有极效应。4. tonB基因的功能研究与RA ATCC野生株相比,tonBl缺失株在LB+Hemin(20μM)中生长缓慢,tonB2缺失株生长更慢,tonB12双缺失株则不能生长,表明tonB1和tonB2在血红素的转运中均起到作用,而tonB2更为重要；RA ATCC野生株和tonB1缺失株在LB+Serum+Dip(40μM)中能生长,tonB2缺失株和tonB12双缺失株则不能生长,表明tonB2在铁离子的转运中起到重要作用：RA ATCC野生株在血红蛋白周围的生长菌圈较大,而tonB1缺失株的生长菌圈稍小,tonB2缺失株的生长菌圈更小,tonB12缺失株的生长菌圈最小,这表明tonB1和tonB2在利用血红蛋白的过程中均起到作用,而tonB2的作用更为重要；RA ATCC野生株能产生较多的生物被膜,而tonB1缺失株,tonB2缺失株和tonB12双缺失株均几乎不产生生物被膜,这表明RA ATCC的tonB基因通过某种机制能影响生物被膜的形成；RA ATCC在LB/LB+Hemin(50μM)或TSB/TSB+Dip(80μM)环境中生长时,3个tonB基因的转录水平均没有显著的差异,这表明RA ATCC的tonB基因的转录可能不受其转运底物血红素和铁离子的调控。