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研究背景：宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,严重危害了女性的生命健康。光动力学疗法(photodynamic therapy, PDT)是一种新兴的肿瘤治疗方法,通过肿瘤细胞对光敏剂的特异性吸收和潴留,给予相应激光照射,选择性地杀伤肿瘤细胞。目前,PDT已先后被批准用于治疗多种恶性肿瘤。阳离子卟啉,即四-(N-甲基-4-吡啶基)卟啉[meso-5,10,15,20-Tetrakis-(N-methyl-4-pyridyl) porphine,TMPyP4],是一种新型光敏剂,在肿瘤的PDT治疗中备受关注。近年来许多学者尝试各种PDT联合方案,旨在提高PDT的抗肿瘤疗效。RNA干扰技术是一种研究肿瘤发病机制及基因靶向治疗的有效手段。最近研究表明：核仁素在包括宫颈癌在内的多种肿瘤细胞中过度表达。本课题首次研究了新型光动力疗法联合基因沉默在体外对宫颈癌细胞的杀伤效应。依据RNA干扰原理,设计合成靶向人核仁素基因的特异性siRNA,转染宫颈癌SiHa细胞,研究其对TMPyP4-PDT光动力学效应的影响,具体研究联合疗法对肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为的作用及可能分子机制,为光动力学疗法联合核仁素基因沉默疗法临床应用于宫颈癌提供理论依据。第一部分核仁素特异性siRNA对宫颈癌细胞中核仁素基因表达的影响及有效片段的筛选研究目的：体外设计合成靶向人核仁素基因的siRNA,转染宫颈癌SiHa细胞,筛选出下调核仁素表达的有效片段,以进行后续实验。研究方法：实验分为6组：3个靶向人核仁素基因的实验组(siRNA-1组,siRNA-2组,siRNA-3组)及3个对照组(siRNA-NC组,空白对照组,正常对照组)。体外合成各组siRNA并瞬时转染宫颈癌SiHa细胞；利用荧光实时定量RT-PCR法和western blot法分别从mRNA和蛋白水平检测核仁素基因的干扰效率,并筛选出干扰效率最高的片段。研究结果：与正常对照组比较,各实验组核仁素mRNA表达水平均下降(P<0.05);蛋白表达水平也相应下调(P<0.05)。siRNA-2为干扰效率最佳的片段。研究结论：核仁素-siRNA可不同程度地下调SiHa细胞核仁素mRNA和蛋白表达水平,siRNA-2片段干扰效率最高,可用于后续实验。第二部分TMPyP4-PDT联合核仁素沉默对人宫颈癌SiHa细胞的体外杀伤作用研究目的：研究TMPyP4-PDT联合人核仁素基因沉默在体外对宫颈癌细胞SiHa的杀伤作用,为TMPyP4-PDT联合核仁素基因沉默疗法临床应用于宫颈癌提供理论依据,试图发现有效的宫颈癌联合治疗方案。研究方法：(1)以宫颈癌SiHa细胞为研究对象,将细胞分为正常对照组、RNAi组、PDT组及联合治疗组(PDT-RNAi组)。在培养过程中给予相应处理。(2)采用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK8)法检测各组细胞增殖活性；(3)采用Annexin V-PI双标记法定量检测各组细胞凋亡率；(4)采用Western blot法检测经各组干预后SiHa细胞Bcl-2和Bax的表达情况。研究结果：(1)CCK8结果显示：与空白对照组比较,RNAi组、PDT组和PDT-RNAi组细胞的生长抑制率明显升高(P<0.01);PDT-RNAi组细胞生长抑制率明显高于PDT组及RNAi组(P<0.05)。经计算联合治疗Q值=1.27,显示PDT及RNAi具有良好的协同增效作用。(2)流式细胞学结果显示：与空白对照组比较,各实验组细胞凋亡比率增加,PDT-RNAi组晚期细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。(3) Western blot结果显示：与正常对照组比较,各实验组Bax表上调(P<0.05),Bcl-2下调(P<0.05),其中以PDT-RNAi组最为显著,其与RNAi组及PDT组比较差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。研究结论：(1) TMPyP4-PDT对SiHa细胞具有良好的体外光动力效应,可抑制肿瘤细胞的增殖并诱导肿瘤细胞发生凋亡；(2)核仁素基因沉默对TMPyP4-PDT具有良好的协同增效作用；推测其机制可能与上调Bax和下调Bcl-2有关。(3) TMPyP4-PDT联合核仁素沉默可能成为光动力疗法治疗宫颈癌,甚至其他肿瘤的新方案。