宏基因组二代测序技术对猪肺组织样本中病毒的检测及其应用

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:delphizhao
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近年来,中国生猪饲养规模不断扩大,猪群中新发病原不断,猪的传染病呈现为旧病未除,而新发传染病不断爆发的特点,严重威胁着养猪业的健康发展。宏基因组新一代测序(Metagenomic next-generation sequencing,m NGS)技术是在Sanger测序之后发展起来的一门用于表征病毒群落的新兴技术。该技术已被广泛地应用于未知病原的检测,成为医学和生物学研究各个领域中的重要工具。本研究应用m NGS技术方法分析了仔猪和母猪肺组织样品中的病毒群落。本文主要进行了以下几个方面的研究:(1)本研究应用m NGS方法分析了仔猪和母猪肺组织样本中DNA病毒群落。测序前,我们对样本进行处理(对照为未处理组),以减少宿主DNA的污染,从而提高信噪比。结果显示,在仔猪样本未处理组中宿主核酸序列占总reads数的82.72%,而在处理组中宿主核酸序列仅占总reads数的0.08%,且在处理组中检测到的猪源性DNA病毒种类及含量均高于未处理组;在母猪样本未处理组中宿主核酸序列占总reads数的2.07%,而在处理组检测到宿主核酸序列占总reads数的1.12%,且检测到多种已知或未知病毒。这表明样本经处理后有效地降低了宿主核酸,从而能提高病毒的检出率。(2)本研究应用SYBR Green I荧光定量PCR技术对m NGS数据库进行验证。通过对所构建的DNA文库进行检测,即对样本中的PCV2、PCV3、PPV这三种DNA病毒进行定性及定量分析。结果显示,仔猪样品呈PCV2阳性,母猪样品呈PCV2、PCV3、PPV(母猪样品处理组PPV外)阳性,而m NGS在母猪样品处理组中检测到15146条PPV序列,这表明m NGS检测结果可信度较高,且满足临床应用的要求。(3)最后,本研究应用m NGS方法分析了仔猪和母猪肺组织样品中的RNA病毒群落。结果显示,样本经处理后能有效提高PRRSV序列的reads数,同时能够检测到多种DNA病毒基因组序列,这表明本文所建立的m NGS检测未知病毒的技术流程适用于猪群样本中病毒病原的鉴定。综上所述,本研究所应用的m NGS技术方法可作为病原体检测的有效补充手段,有助于为新发猪病毒性传染病的监测提供技术支持,有助于对猪疫病的诊断提供可靠的资料,保障养猪业的健康发展。
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