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恐惧是当个体感知到危险或者威胁的时候产生的主观感觉。恐惧行为对于人和动物在自然界的生存具有积极的意义,然而对于生活在现代社会的人类个体,过分的恐惧也能够对生活和工作带来消极作用,严重者甚至产生不必要但无法控制的过度恐惧症状。理解恐惧情感,解析恐惧行为的发生机制具有重要意义。理解恐惧这一人类基本情感的关键在于解析恐惧行为所依赖的神经环路及其细胞、分子机制,这已经是神经科学家之间的共识。相关研究发展出了两类不同的恐惧行为机制,一种是“内源性恐惧”,它是由个体天然存在的心理因素和遗传因素诱发的恐惧情感;另一种是“习得性条件恐惧”,它是个体在后天的环境中经历有害刺激,诱发了个体天然存在的恐惧情感,然后通过对有害刺激的学习记忆而获得的恐惧。长期以来人们普遍认为杏仁核对于习得性条件恐惧具有重要意义,而后来的研究表明,内侧前额皮层可能也参与了对恐惧形成和表达的调节。内侧前额皮层包括背侧前扣带回(dorsal anterior cingulate area,Acd),边缘前区(prelimbic cortex area,PL)和边缘下区(infralimbic area,IL)。PL 投射到基地杏仁核(Basal amygdala,BA),且BA神经元在PL神经元动作电位之后发放。亦有研究表明,PL的失活降低条件性恐惧的表达,但不影响恐惧记忆的形成过程。这些研究提示PL脑区与恐惧的表达有密切关系,但PL脑区的活动对于恐惧的形成过程则不是必要的。然而,PL脑区对恐惧表达的作用受何种分子机制调节尚不清楚。过去的研究报道了 NRG1及其受体ErbB4是习得性条件恐惧表达缺陷的易感基因,近期也有研究提示NRG1和ErbB4所介导的信号通路在杏仁核能够调节恐惧的表达。NRG1是一种可分泌到胞外的神经调节因子,其受体ErbB家族是一种跨膜受体酪氨酸激酶,以二聚体的形式存在。由于在ErbB受体家族中,只有ErbB4亚型功能完整,既能够结合NRG1配体又具有酪氨酸激酶活性,因此NRG1-ERbB4信号通路受到更多的关注。我们知道mPFC和恐惧的表达有着密切的关系,而NRG1-EbrB4信号通路在mPFC对恐惧表达的影响仍不清楚。因此在这项研究中,我们通过药理学手段,病毒干扰技术,基因敲除小鼠等技术手段,观察NRG1-ErbB4信号通路对恐惧表达的影响。我们得到了以下结果:1.中和PL脑区的内源性NRG1损伤恐惧的表达,而中和IL脑区则无影响过去的研究显示在mPFC,IL和PL两个脑区对于恐惧的表达有相反的影响,因此我们首先探讨了 NRG1在PL和IL两个脑区中对声音诱导的条件性恐惧表达的影响。恐惧训练后,通过埋植的导管向IL脑区或者PL脑区给予ecto-ErbB4多肽溶液,以中和内源性的NRG1。结果表明,中和PL区的NRG1减少恐惧记忆的表达,而IL脑区中的NRG1减少并不影响恐惧表达。这些结果提示PL脑区而不是IL脑区的NRG1对恐惧形成有重要作用。2.在PL脑区给予外源性NRG1能够增强恐惧表达接下来我们验证了在PL脑区给予外源性NRG1是否会影响恐惧的表达。结果表明,在检测前半小时给予外源性NRG1溶液显著增强了小鼠的恐惧表达,这进一步证明了 NRG1对于恐惧表达的重要性。3.阻断PL脑区中ErbB4受体降低恐惧表达为了证明NRG1的功能性受体ErbB4在恐惧表达中的重要意义,我们在PL脑区注射一种高效EGFR选择性抑制剂AG1478,观察恐惧表达是否受影响。结果可见,给予AG1478的小鼠恐惧表达显著减弱,表明PL脑区中ErbB4受体对恐惧表达具有重要意义。4.ErbB4缺失的小鼠的恐惧形成和表达受损为了进一步检验ErbB4对习得性条件恐惧的影响,我们使用了 ErbB4基因敲除的小鼠(ErbB4-/-)进行条件性恐惧实验。ErbB4-/-小鼠的疼痛反应阈值与野生型小鼠没有显著性差异。然而ErbB4-/-小鼠恐惧形成受损,恐惧表达也显著下降。这些结果与上述研究结果相符,但也提示了 ErbB4对恐惧形成的影响。5.在PV阳性的抑制性神经元敲除ErbB4损伤恐惧表达,而在CaMKⅡα阳性的兴奋性神经元敲除ErbB4则不影响恐惧表达过去研究报道,在皮层,ErbB4主要表达于中间神经元,而PV神经元是主要的抑制性中间神经元类型。为了探索ErbB4对于恐惧表达的影响主要是在何种神经元上的作用,我们使用了在PV神经元特异性敲除ErbB4的小鼠品系PV-Cre;ErbB4f f和在椎体神经元特异性敲除ErbB4的小鼠品系CamKⅡ-Cre;ErbB4f f进行条件性恐惧实验,对照组均为ErbB4f/f。结果显示各组小鼠的恐惧形成和疼痛阈值均没有受到影响。PV-Cre;ErbB4f/f小鼠恐惧表达下降,而CamKⅡ-Cre;ErbB4f/f恐惧表达与对照组一致。这个结果提示NRG1对恐惧表达的调节作用可能是由抑制性PV神经元的的ErbB4介导的,而不是兴奋性的CaMKⅡα神经元,同时也表明ErbB4对恐惧形成的影响可能由这两种神经元之外的其他细胞类型介导。6.敲低PL脑区的ErbB4可降低恐惧的表达为了进一步验证ErbB4对恐惧表达的作用是否通过PL脑区介导,我们向ErbB4-loxp小鼠的PL脑区注射AAV-CAG-Cre-GFP敲低该脑区的ErbB4表达量,对照组注射AAV-CAG-GFP。我们发现,虽然恐惧的形成和疼痛阈值没有改变,注射AAV-CAG-Cre-GFP的小鼠恐惧表达比对照组显著降低,说明ErbB4对恐惧表达的作用是通过PL脑区介导的。7.向PL脑区给予LV-ErbB4可逆转PV-Cre;ErbB 4--小鼠受损的恐惧表达为了证实ErbB4的作用,我们将携带外源性ErbB4基因的LV-ErbB-GFP注射到PV-Cre;ErbB4 小鼠的PL脑区,注射三周后病毒充分表达于PL脑区。在PL脑区过表达ErbB4逆转了 PV-Cre;ErbB4--小鼠受损的恐惧表达,证明了 PL中的ErbB4对于恐惧记忆具有重要意义。综上所述,我们的结果证明了在PL脑区,NRG1-ErbB4信号通路参与了对恐惧表达的调节,PV中间神经元可能起了重要作用。在PL脑区中和NRG1、抑制ErbB4功能或者降低ErbB4表达量能够降低恐惧记忆的表达,而外源注射的NRG1能够增强恐惧记忆的表达。过去的研究表明PL脑区的兴奋性与恐惧表达呈正相关,例如向PL脑区注射河豚毒素(TTX)以阻断神经元的兴奋性能够损伤恐惧表达,而使用光遗传技术抑制PL脑区的PV神经元则能够增强恐惧表达。也有研究报道,在PFC,NRG1促进PV神经元GABA的释放,提示NRG1可能是降低mPFC的兴奋性的。但是在我们的研究中,我们采取阻断ErbB4信号通路的技术路线得到了相反的结果,这似乎与之前的研究结果有矛盾之处。这一矛盾提示我们,PV神经元对PL脑区的抑制性作用在恐惧表达中的作用可能并非单一的促进或抑制,而是有着更加特异和复杂的调节方式。PL脑区的PV神经元兴奋的程度,由PV神经元释放的GABA以外的其它物质,以及PL脑区向其它脑区投射对于BLA脑区的间接作用,都可能对恐惧表达产生影响,而这些可能的调节机制还需要进一步的研究来阐明。