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众所周知急性脑梗死可引起不同程度的神经功能损伤,不仅影响患者的生存质量,严重者还可危及生命。与缺血预处理在临床中的难以操作性相比,非缺血预处理的方法更具有临床应用性及研究价值。异氟烷作为吸入麻醉剂,已经被广泛应用于临床,有研究证明其具有一定功效的脑保护作用。目前已证实确有保护作用的研究表明,所采用的实验模型几乎都是单次缺血预处理,所诱导的也是短暂而快速的缺血耐受。长期重复异氟烷预处理是否对脑缺血再灌注损伤有叠加性的增强保护作用,是否可以随预处理时间的延长而使保护作用加强还未明确证实。人参皂甙对脑缺血损伤确有保护作用[1],但其研究多限于人参总皂甙或人参二醇组皂甙,二者均是多种单体的混合成分,其作用的强弱与所含单体的不同有关[2-5]。目前已确定结构的皂甙单体至少在40种以上,但只有人参皂甙-Rd等少数单体已经进入到临床三期试验,可以在临床上使用。现阶段对人参皂甙单体Rd的研究仅限于缺血后的保护作用,尚无有关人参皂甙-Rd预先给药是否有脑保护效应的报道。而对于围术期脑缺血,预先给药无疑更具意义。因此本实验采用大鼠大脑中动脉阻闭(MCAO)模型,从长期重复异氟烷预处理和人参皂甙-Rd预先给药这两种临床方便可行的保护作用方式入手,探讨其对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用,旨在进一步为脑缺血性损伤选择更好的保护方法。第一部分重复异氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用目的1.研究重复异氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用2.探讨COX-2在重复异氟烷预处理脑保护中的作用方法1重复异氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用雄性SD大鼠50只(280～320g),9～10周龄,随机分为5组(每组10只)。对照组(CON):即缺血再灌注组、ISO5d组、ISO10d组、ISO15d组和ISO20d组。每天同一时间吸入1小时相同浓度异氟烷(1.5%)与空气的混合气体分别连续不同天数。50只大鼠随机分批次放入特制的吸入麻醉药预处理箱内,经进气孔通以空气及ISO的混合气体,另一监测孔连接到麻醉气体分析仪上,以便持续监测箱内气体浓度。此装置为我实验室专用特属动物预处理箱。每日进行1h异氟烷与空气混合气体的预处理,每组动物吸入天数不同。所有大鼠均采用我科经典的大脑中动脉阻断(MCAO)模型。分别于再灌注24h、48h和72h进行神经行为学评分(neurologic behavior scores, NBS),并于最后一次神经行为学评分后将所有大鼠断头取脑测量脑梗死容积百分比。2.COX-2在重复异氟烷预处理脑保护中的作用清洁级雄性SD大鼠20只,随机分为四组(n=5),即正常组(Normal)、ISO10d组、ISO20d组和对照组(CON)。所有试验大鼠缺血再灌注24h后,均用多聚甲醛灌注,取脑,制作成冰冻切片,进行免疫组织化学染色。1.重复异氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用ISO5d组、ISO10d组、ISO15d组于再灌注24h、48h和72h后神经行为学评分明显优于单纯对照组(P<0.05),ISO20d组与对照组之间无显著性差异(P>0.05),ISO10d组神经行为学评分明显高于各组(P<0.05)。脑梗死容积百分比结果,再灌注72h后ISO5d、ISO10d和ISO15d组的脑梗死容积百分比分别为(31.60±9.00)%、(26.90±8.26)%、(35.20±5.37)%和均明显小于CON组的(49.30±6.00)%(P<0.05),ISO20d组(51.50±7.84)%与CON组无明显统计学差异(P>0.05),且以ISO10d组的脑梗死容积最小(P<0.05)。ISO10d组与ISO15d和ISO20d组相比,脑梗死容积百分比明显增加(P<0.05);ISO10d和ISO5d组相比则无统计学差异(P>0.05)。2. COX-2在重复异氟烷预处理脑保护中的作用COX-2细胞在大鼠脑皮质中阳性表达结果显示:CON组和ISO20d组COX-2细胞阳性免疫反应强度明显高于Normal组和ISO10d组(P<0.05),而Normal组和ISO10d组相比无明显差异,无统计学意义(P>0.05);与CON组相比,ISO10d组COX-2细胞阳性免疫反应强度明显减弱,且阳性细胞表达数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分人参皂甙-Rd对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用目的1.研究人参皂甙-Rd对脑缺血再灌注损伤保护作用的剂量-效应关系2.探讨COX-2在人参皂甙-Rd脑保护中的作用方法1.人参皂甙-Rd对脑缺血再灌注损伤保护作用的剂量-效应关系健康的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只,9～10周龄,体重280～320g(由第四军医大学实验动物中心提供)。随机分为7组(n=10),即缺血再灌注组(CON组)、Rd5mg/kg组、Rd10mg/kg组、Rd20mg/kg组、Rd40mg/kg组、Rd80mg/kg组和丙二醇组(VEC组)。各Rd组SD大鼠分别于MCAO前1小时腹腔注射稀释至6ml等容积量不同浓度人参皂甙-Rd。VEC组SD大鼠于MCAO前1小时腹腔注射丙二醇6ml。2.COX-2在人参皂甙-Rd脑保护中的作用清洁级雄性SD大鼠20只,随机分为四组(n=5),即正常组(Normal)、Rd40mg/kg单纯给药组(Rd 40’组)、CON组和Rd40mg/kg组(Rd40组)。Rd 40组为在制作大鼠中动脉堵闭模型MCAO前1h经大鼠腹腔单次给予Rd40mg/kg,Rd 40’组为不做MCAO模型的大鼠,仅腹腔单次给予Rd40mg/kg一次。所有试验大鼠缺血再灌注24h后,均用多聚甲醛灌注,取脑,制作成冰冻切片,进行免疫组织化学染色。结果1.人参皂甙-Rd对脑缺血再灌注损伤保护作用的剂量-效应关系神经行为学评分,Rd5mg、Rd10mg、Rd20mg、Rd40mg和Rd80mg组在I/R后24h、48h和72h的NBS较CON组均有明显提高(P<0.05),且剂量小于40mg/kg时,随Rd剂量增加而增加(P<0.05)。但Rd80mg组NBS低于Rd20mg和Rd40mg组(P<0.05),与Rd5mg、Rd10mg两组相比无明显差异(P>0.05)。VEC组与CON组相比无明显差异(P>0.05)。脑梗死容积百分比结果,再灌注72h后Rd5mg、Rd10mg、Rd20mg、Rd40mg和Rd80mg组的脑梗死容积百分比分别为(34.80±4.31)%、(29.60±4.22)%、(24.70±3.37)%、(17.50±3.10)%和(31.60±5.70)%,均明显小于CON组的(51.10±6.60)%(P<0.05),且以Rd40mg组的脑梗死容积最小(P<0.05)。Rd80mg组与Rd40mg和Rd20mg组相比,脑梗死容积百分比明显增加(P<0.05),与Rd5mg和Rd10mg组相比则无统计学差异(P>0.05)。根据实验数据我们绘制出Rd与脑梗死容积之间的量效关系曲线,发现在5 -40mg/kg之间有一定的剂量效应关系。2.COX-2在人参皂甙-Rd脑保护中的作用COX-2细胞在大鼠脑皮质中阳性表达结果显示:CON组的COX-2细胞阳性免疫反应强度明显高于Normal组和Rd40’组(P<0.05),而Normal组和Rd40’组相比则无明显差异,无统计学意义(P>0.05);与CON组相比Rd40组COX-2细胞阳性免疫反应强度明显减弱,且阳性细胞表达数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.一定浓度的ISO重复预处理的脑保护作用以重复10天的保护效果为最佳;当预处理至20天时,保护作用反而消失。2.人参皂甙-Rd预先给药可明显减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤,并有一定的剂量效应关系,且以Rd40mg/kg为最佳剂量。3.重复ISO预处理及人参皂甙-Rd的脑保护作用可能与其抑制了大脑皮质中COX-2的表达有关。