恶性肿瘤的发病率已经跃居疾病谱的第二位,而且随着环境污染的加剧、人口老龄化等因素的影响,还呈进一步上升的趋势。迄今为止人们对恶性肿瘤的发生发展机制仍然没有完全清楚。随着研究的深入,人们发现恶性肿瘤的生长、转移和复发的特点与正常干细胞有许多惊人的相似之处,并据此提出了肿瘤干细胞学说。该学说认为,肿瘤中存在一部分独特的具有自我更新和分化功能的干细胞样亚群并将之称为肿瘤干细胞(又称肿瘤起始细胞或成瘤性癌细胞),这一亚群细胞正是肿瘤的起源细胞并维持肿瘤的生长。肿瘤干细胞学说从一个全新的角度诠释了肿瘤的发生、发展本质,使肿瘤的靶向性、根治性治疗看到希望。然而,尽管越来越多的证据证明肿瘤干细胞的存在,但是目前尚未有一个肿瘤干细胞的具体形态或特异性标记物被证实,肿瘤干细胞学说在临床应用的研究方面也未取得突破性进展。造成上述情况的主要原因一方面是因为肿瘤干细胞的研究起步不久,还缺乏有效的技术手段和实验方法;另一方面,人们对于肿瘤干细胞的生物学行为和相关的分子机制也是知之甚少。因此,研究肿瘤干细胞的生物学行为及其机制对于了解肿瘤的发生发展、诊断预后和靶向治疗等方面具有特殊意义和重要作用。乳腺癌肿瘤干细胞是第一个被证实存在的实体瘤干细胞, CD44+/CD24-/low被认为是乳腺癌干细胞的分子表型。然而,由于受到复杂环境的影响,肿瘤干细胞在生长发展的过程其分子表型也可能会出现变化,分子表型作为肿瘤干细胞特异标记的可靠性仍然存在争议。因此,现阶段肿瘤干细胞的鉴定金标准仍然是通过连续移植成瘤的方法来体现肿瘤干细胞自我更新和多向分化的功能。但是体内成瘤的鉴定方法因为移植部位的环境变化及宿主残余的免疫抵抗对研究的结果造成严重影响。对于已适应体外培养环境的肿瘤细胞株而言采用体外克隆及体内成瘤相结合的模式来鉴定其中肿瘤干细胞可能更为可靠。本研究即以人乳腺癌MCF7细胞株为研究对象,采用“单细胞移植-成瘤性克隆”的模式在单细胞水平对其中肿瘤干细胞的增殖特点及影响因素进行研究,进一步利用差异蛋白组技术研究与肿瘤干细胞增殖相关的差异表达蛋白。为今后肿瘤干细胞的生物学行为研究奠定基础。研究目的:研究适用于鉴定细胞株中肿瘤干细胞的方法;研究人乳腺癌MCF7细胞株中CD44+/CD24-/low亚群与肿瘤干细胞的相关性,探索体外培养环境下肿瘤干细胞的增殖特点及影响因素,并通过差异蛋白组学研究与肿瘤干细胞增殖相关的基因蛋白。研究方法:1.单细胞分离种植装置和技术研究:在显微操作法的基础上采用微量移液器及小号静脉注射针组合制作单细胞分离种植装置,并在实践中摸索最佳的单细胞分离种植方法。2.在单细胞水平建立人乳腺癌MCF7细胞株中肿瘤干细胞的鉴定模式:即将单细胞分离种植到96孔板(单细胞/孔)后观察单细胞克隆形成,记录来源于单细胞的克隆特征并随机扩增部分克隆,最后通过裸鼠移植形成肿瘤。把这些来源于单细胞且能够移植成瘤的克隆命名为成瘤性克隆。根据单细胞克隆的生长特征归纳制定成瘤性克隆的纳入标准并经过验证后应用于后续的研究。3.通过研究成瘤性克隆形成率的方法鉴定MCF7细胞株中肿瘤干细胞的比例,利用这一方法动态研究传代培养后的MCF7细胞在不同时间点其中的肿瘤干细胞比例的变化规律,获得影响肿瘤干细胞增殖的因素,采用流式细胞技术同步检测CD44+/CD24-/low亚群,分析肿瘤干细胞亚群与CD44+/CD24-/low亚群的相关性;4.利用PF-2D和MALDI-TOF/MS技术平台研究与肿瘤干细胞增殖相关的基因蛋白。研究结果:1.研究使用的单细胞分离种植装置及操作技术可获得大于90%的单细胞分离种植成功率,分离种植的速度可达到3-6个细胞/分钟。2.建立了“单细胞移植-成瘤性克隆”的肿瘤干细胞鉴定模式,成瘤性克隆的鉴定标准为:①单细胞种植后1周即形成细胞数>50个的克隆,细胞大小形态正常,大部分细胞状态良好和②第2周观察时克隆迅速扩增至300-1000个细胞以上,细胞状态好,克隆中心可有(或无)少量细胞凋亡。3.传代培养后的MCF7细胞在不同时间点其成瘤性克隆率及CD44+/CD24-/low亚群比例均呈现有规律的变化。但CD44+/CD24-/low亚群变化更为显著(36.84%到81.95%),而成瘤性克隆率仅在小范围波动(38.54%到47.39%)。CD44+/CD24-/low亚群比例并非任何时候都大于或等于肿瘤干细胞的含量;分析显示CD44+/CD24-/low亚群与肿瘤干细胞亚群有一定程度的正相关性,相关系数为0.748(P<0.001);进一步对CD44+/CD24-/low亚群和肿瘤干细胞亚群的变化规律分析发现CD44+/CD24-/low亚群主要与肿瘤干细胞亚群增殖分裂事件有关,即肿瘤干细胞新分裂的子代细胞无论是否是干细胞其表型均可能表现为CD44+/CD24-/low,而这一亚群会随着培养时间的推移出现再次分裂或者逐渐转变为CD44+CD24+亚型;肿瘤干细胞亚群比例受到培养基中血清浓度的影响,低血清培养可显著提高MCF7细胞中肿瘤干细胞的比例(由27.6%增加到49.3%,P<0.01),并增加肿瘤干细胞对称分裂的比例(由占肿瘤干细胞总数的17.1%增加到39.7%,P<0.05)。4.对低血清浓度及常规培养的MCF7细胞差异表达蛋白分析获得一些可能与肿瘤干细胞增殖相关的基因蛋白,如与促进肿瘤增殖浸润相关的核酸酶感受元件结合蛋白1(Y盒结合蛋白1)、生长调节致癌基因α、β淀粉样蛋白A4及桥粒斑蛋白III等在低血清培养的MCF7细胞中表达上调,而抑制肿瘤浸润转移的间-α胰蛋白酶抑制物重链H4等蛋白则表达下调。研究结论:1.单细胞分离装置及操作技术具有取材容易、制作简单、操作直观可靠、分离成功率高、易于推广普及的特点,有力的保证实验数据的准确性,同时满足鉴定细胞株中肿瘤干细胞所要求的单细胞数量。2.“单细胞移植-成瘤性克隆”的模式适合用于鉴定体外培养的人乳腺癌MCF7细胞中的干细胞亚群含量。3.CD44+/CD24-/low亚群主要与肿瘤干细胞亚群增殖分裂事件有关,但不具有代表或富集乳腺癌MCF7细胞中干细胞亚群的作用。4.在体外培养的环境MCF7细胞中肿瘤干细胞可能通过调节自身增殖来保持其比例的相对稳定。5.低血清培养可提高肿瘤干细胞的含量,并增加肿瘤干细胞对称分裂的比例。6.低血清培养环境可能通过诱导或抑制多种与肿瘤生长、浸润和转移有密切关系的基因蛋白表达来促进肿瘤干细胞的增殖,而肿瘤干细胞的增殖则可能是乳腺癌干细胞向恶性程度更高的表型演进的重要方式。7.肿瘤干细胞增殖规律及影响因素的研究对深刻理解肿瘤发生、发展的本质和肿瘤防治策略的提出、研究具有重要的指导意义。